四种樟属植物POD、EST同工酶电泳分析

陈鹏，练涛，杜永华，魏琴，伍自力

（宜宾学院香料植物资源开发与利用四川省高校重点实验室，四川宜宾644007）

四种樟属植物POD、EST同工酶电泳分析

陈鹏，练涛，杜永华，魏琴，伍自力

（宜宾学院香料植物资源开发与利用四川省高校重点实验室，四川宜宾644007）

通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）对香樟、油樟、大叶樟、天竺桂四种樟属植物过氧化物同工酶（POD）、酯酶（EST）进行分析.电泳检测结果显示，香樟、油樟、大叶樟、天竺桂的POD同工酶各有4、4、3、6条条带，EST同工酶各有4、3、3、3条条带，四种植物的POD、EST同工酶酶谱之间存在共性和差异性.共性条带（POD的P4和EST的P1）体现了同为樟属植物的特征，差异性条带体现了物种特异性和种间的亲缘关系.大叶樟与天竺桂酶谱差异较大，亲缘关系较远，香樟与油樟酶谱差异较小，亲缘关系较近.这与形态方面的分类相一致.

樟属;过氧化物同工酶;酯酶

油樟（Cinnamomum longepaniculatum(Gamble) N.Chao ex H.W.Li）、香樟（Cinnamomum camphora (L.)Presl）、大叶樟（Cinnamomum septentrionale Hand.-Mazz.）、天竺桂（Cinnamomum septentrionale Hand.-Mazz.）是樟科樟属重要经济植物，其提取物在香料、医药、化工、食品及国防工业有广泛应用[1-6].这些樟属植物还是重要的园林观赏树种，具有重要的生态地位[7-9].很多樟属植物形态差异不大，特别是在幼苗时期其种子等仅从形态差异是难以区分的，为林业种苗的识别带来了一定的麻烦.同工酶普遍存在于生物界，包括脊椎动物、昆虫、植物以及单细胞生物，是催化反应相同而结构、理化性质不同的一组酶[10].其涉及酶的种类也很多，他们的存在与生物的代谢、细胞的分化、胚胎的发育和形态建成等都有密切的关系.同工酶电泳图谱谱带发生多态性变化，反映了生物在蛋白质水平上的多型性，是生物发生遗传分化的证据[11].同工酶是基因表达的产物，不同的组织其同工酶的表达也是不同的，同工酶酶谱在一定程度上反映了生物的系统发生.因此，利用同工酶分析技术,从分子水平从遗传背景方面来寻找植物种类间的亲缘关系，在一定程度上弥补形态分类的不足.目前国内樟科植物同工酶分析仅见毛豹皮樟[12]，而对本实验涉及的四种樟属植物同工酶分析未见报道.为了更好地了解油樟、香樟、大叶樟、天竺桂四种樟属植物分类及亲缘关系，本实验利用SDS-PAGE对四种樟属植物过氧化物同工酶（POD）和酯酶(EST)同工酶进行分析，为樟属的分类鉴定提供生化依据基础.

1 材料与方法

1.1 材料

四种樟属植物一年生嫩叶采自校园内，分别编号为香樟（A1）、油樟（A2）、大叶樟（A3）、天竺桂(A4)，在4℃冰箱下低温保存，备用.

1.2 方法

1.2.1 酶液制备

取香樟、油樟、大叶樟、天竺桂嫩叶各0.5 g，加入1mL提样缓冲液(0.1mol/L Tris-HCl pH=8.0)、少许石英砂，置冰浴研磨后，8 000 r/min离心5min，上清液即为酶粗提液，取上清液保存于-20℃冰箱备用.

1.2.2SDS-PAGE

采用SDS-PAGE的方法，分离胶的浓度为7.5%，分离胶缓冲液为pH8.9的Tris-HCL溶液；浓缩胶浓度为3%，浓缩胶缓冲液为pH6.7的Tris-HCL溶液；电极缓冲液为pH8.3的Tris-Gly溶液.

1.2.3 电泳

从-20℃冰箱中取出样品，4℃下解冻，取30mL初酶液，加入10mL 0.005%溴酚蓝，再加入3～5滴甘油，制成电泳样品.样品点样量为30mL，在4℃的冰箱中，先120 V恒压电泳1 h，然后200 V电泳2 h,待酚蓝走到距凝胶末端1 cm处时，停止电泳.

1.2.4 染色

POD采用醋酸－联苯胺法染色[13]，联苯胺染色液：称取联苯胺1 g，冰醋酸18mL，加水2mL，配成联苯胺母液，然后量取0.5mL联苯胺母液，0.2mL 3%H2O2，加蒸馏水9.3mL，配成染色液.常温下染色5～10min，水冲洗，3%的醋酸固定，拍照.EST同工酶染色[14]，取100mg坚牢蓝RR盐溶于4mL 1g/ 100mL丙酮-β-乙酸萘脂和4mL 1g/100mL丙酮-α-萘乙酸中，在染色前约1min加入150mL 1.0moL/ L磷酸钾缓冲液（pH6.0），配成酯酶染色液.室温下染色30～45min，取出胶板用蒸馏水漂洗后用7%的醋酸固定，拍照.

1.3 数据分析

通过对POD、EST两种同工酶的酶带条数分析，计算出不同酶的Rf值及相似系数C.计算方法为：

式中n1为A材料酶谱的谱带数，n2为B材料酶谱的谱带数，n为A、B中相同的酶带数.

2 结果与分析

2.1 POD同工酶酶谱分析

四种樟属植物过氧化物同工酶电泳结果见图1和图2.四种植物共电泳出8条酶带，分别是P1、P2…P8.A1电泳出4条酶带P1、P3、P5、P6，一条深带P4，两条浅带P1、P3，一条最浅带P5.A2有四条带，三条深带P1、P3、P4和一条浅带P6.A3有三条浅带P4、P5、P8.A4有六条带三条深带P1、P2、P3，三条浅带P4、P6、P7.条数最多的是A4有六条酶带，酶带条数最少的是A3有三条浅的酶带，其中P4（Rf=0.67）是四种植物的共同酶带，P1（Rf=0.47）和P3(Rf=0.62)是A1、A2、A4的共同酶带.种间差异较大的是P2、P7、P8这三条酶带，是该植物的特征酶带.四种植物的POD同工酶酶谱均存在差异，表明POD同工酶的种类专一性.

图1 四种樟科植物POD同工酶电泳图谱Fig.1 Four kindsof lauraceae plants POD electrophoresis

图2 四种樟科植物POD电泳模式图Fig.2 Four lauraceae plants POD isozyme pattern

2.2 EST同工酶酶谱分析

四种植物EST同工酶酶谱带及其模式图如图3和图4所示.从图3、图4可以看出，四种材料间酯酶同工酶之间的差异，呈现多态性，共电泳出6条酶带，A1有四条带，三条深带P1、P4、P5，一条浅带P6. A2有三条带，两条深带P1、P5，一条浅带P5.A3有三条带，一条深带P5，一条浅带P1及一条最浅带P2. A4三条带，两条深带P1、P5，一条浅带P3.其中A1酶带条数最多有4条，其余均为三条.P1（Rf= 0.47）、P4(Rf=0.61)为四种材料的共同酶带，而P2（Rf=0.53）、P3（Rf=0.58）、P6（Rf=0.76）这三条酶带分别为材料A3、A4、A1的特征酶带.在A1材料中有三条深带及一条浅带，A2、A4材料中均有两条深带及一条浅带，A3中有一条深带、一条浅带及一条最浅带.各种材料酯酶同工酶的酶谱特征各有差异.

图3 四种樟科植物EST电泳图谱Fig.3 Fourkinds of lauraceae plants ESTelectrophoresis

图4 四种樟科植物EST电泳模式图Fig.4 Fourkindsof lauraceae plants EST isozyme pattern

2.3 相似系数计算和亲缘分析

四种樟属植物之间的相似系数见表1.相似系数越大，遗传距离越小，说明种质资源的亲缘较近；相反，种质资源的亲缘较远[15].从表1可以看出四种植物间的相似系数在0.22～0.67之间，A1和A2之间的相似系数较大说明它们之间的亲缘关系较近，而A3和A4及A2和A3之间相似系数较小说明它们之间的亲缘较远.

表1 樟科四种植物之间的相似系数Table 1 Lauraceae similarity coefficientbetween the four kindsofplants

3 讨论

POD、EST同工酶酶谱表明，四种樟属植物同工酶酶谱具有一些共有带，但酶带数量与活性强度有差异，此可作为四种樟属植物种源鉴定的生化指标之一.除用同工酶电泳的方法来种间关系及种的鉴定外，分子标记也被运用于遗传资源及亲缘关系的研究，如RFLP、RAPD、ISSR、SSA等[16-18].但对樟属植物的分子标记分析来研究种间关系却报道较少，仅见香樟的分子标记和遗传分析[19-20].

通过对POD同工酶研究表明，香樟、油樟、大叶樟、天竺桂各有4、4、3、6条条带，而EST同工酶有4、3、3、3条条带，且在酶带数量及深浅方面均存在差异.从POD同工酶研究四种材料间的亲缘关系表明，香樟与油樟酶谱差异较小，亲缘关系较近；大叶樟与天竺桂酶谱差异较大，亲缘关系较远.这为进一步了解这几种植物进化关系提供参考.

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【编校：王露】

Peroxidase Isozyme and Esterase Isozyme Analysis on Four Lauraceae Plants

CHENPeng,LIAN Tao,DUYonghua,WEIQin,WU Zili
(Key Laboratory ofAromatic Plant Resources Exploitation and Utilization in Sichuan Higher Education Institution,Yibin University,Yibin,Sichuan 644007,China)

The relative relationships of different varietieswere defined by the comparison and analysis of isozyme zymograms.The reference for the aspectsof classification,varietiesappraisaland genetic breeding of Lauraceae plantswere offered.With themethod of polyacrylamide gel electronphoresis,peroxidase isozyme and esterase isozyme of four plant in genus of Lauraceae were observed and analyzed.The POD and EST electrophoresis testof four kinds of Lauraceae plants show that POD isozyme of Cinnamomum camphora(L.)Presl,Cinnamomum longepaniculatum(Gamble)N.Chao ex H. W.Li,Cinnamomum septentrionale Hand.-Mazz.,and Cinnamomum septentrionale Hand.-Mazz.each contain 4,4,3,6 bands,and EST isozyme research shows that there are 4,3,3,3 bands respectively.POD and EST isozyme zymogram differences of these four plants indicate that the types of POD and EST isozyme bear specificity.The enzyme of POD isozyme and EST isozyme of the four plants differs in depth,etc.,indicating that despite some common bands in POD and EST isozyme zymogram,the number and enzyme activity intensity have differences;The difference in enzyme zymogram between Cinnamomum septentrionale Hand.-Mazz.and Cinnamomum septentrionale Hand.-Mazz,is significantand have a distant relationship.The difference in enzyme zymogramb between Cinnamomum longepaniculatum(Gamble)N.Chao ex H.W.Liand Cinnamomum camphora(L.)Presl issmall,and have closer relationship.This is consistentwith the traditionalmorphological classification.

Lauraceae;peroidase isozyme;esterase isozyme

Q946.5

A

1671-5365(2014)12-0033-03

2014-05-20修回：2014-07-01

四川省教育厅项目（08ZA002）；四川省科技计划项目（2010JY0093）；四川省青年科技创新研究团队项目（2011JTD0035）；宜宾市科技局项目（2011ZSF008）

陈鹏（1990-），男，本科生，生物科学专业

魏琴（1967-），女，教授，博士，研究方向为资源植物学

时间：2014-09-12 13:00

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1630.Z.20140912.1300.003.htm l