食管癌组织中CT10激酶调节子样蛋白和细胞增殖核抗原Ki67的表达及其临床意义

赵 智，谢立群，罗俊卿，简 明，刘 展

食管癌组织中CT10激酶调节子样蛋白和细胞增殖核抗原Ki67的表达及其临床意义

赵 智1，谢立群2，罗俊卿1，简 明1，刘 展3

目的 探讨食管癌组织中CT10激酶调节子样蛋白(CT10 regulator of kinase like protein，CRKL)及细胞增殖核抗原Ki67的表达及与病理学特征的相关性。方法 采用免疫组化(SP)法，检测60例食管癌组织及与其配对的56例正常癌旁组织中的CRKL及Ki67蛋白表达情况。结果 CRKL蛋白在食管癌中阳性表达率为56.7%(34/60)，明显高于在正常癌旁组织的阳性表达率5.4%(3/56，P<0.01)；其表达与食管癌分化程度(P=0.027)、TMN分期(P=0.029)、浸润深度(P=0.049)及淋巴结转移 (P=0.012)有关，与患者年龄、性别、肿瘤大小、部位无关(P>0.05)。Ki67蛋白在食管癌中阳性表达率为68.3%(41/60)，明显高于在正常癌旁组织的阳性表达率9.1%(5/56)(P<0.01)；其表达与肿瘤的TMN分期(P=0.006)、淋巴结转移 (P=0.028) 有关，与患者年龄、性别、肿瘤大小、部位、分化程度、浸润深度无关(P>0.05)。CRKL及Ki67蛋白在食管癌组织中的表达呈正相关(r=0.352，P=0.006)。结论 检测CRKL及Ki67可判断食管癌的恶性程度，CRKL可成为食管癌预后的临床预测指标及分子治疗的新靶点。

食管癌；CT10激酶调节子样蛋白；细胞增殖核抗原Ki67；免疫组化SP法

食管癌是一种常见的消化系统恶性肿瘤，发病率、病死率高，发病因素复杂[1]。寻找一种与食管癌恶性生物学行为密切相关的生物学标记物，对早期诊治及预后判断具有重要的临床意义。CRKL蛋白是CRK信号接头蛋白家族中的一员，能调节细胞内、外蛋白与蛋白之间反应，参与多个信号通路的传导[2]，与多种肿瘤有着重要关联。Ki67蛋白是一种与细胞有丝分裂相关的蛋白质，与细胞增殖密切相关，是反映肿瘤细胞增殖活性的公认标记物[3]，其高表达对于恶性肿瘤的发生、转移及预后产生重要影响。本研究通过检测食管癌组织中CRKL及Ki67的表达，并联合临床病理参数进行分析，探讨其在食管癌发病、病情进展中的作用及相互之间关联，为食管癌的诊断、治疗及预后判断提供依据。

1 对象与方法

1.1 对象 收集武警湖南总队医院及湖南省人民医院2013-03至2013-08胸外科手术切除的原发性食管癌组织60例及距肿瘤组织5 cm以上的正常食管组织56例，食管癌经术后病理证实均为鳞状细胞癌，其中男47例，女13例，年龄28～83岁，平均61.42岁。肿瘤位于食管上段12例，中段27例，下段21例。TMN分期：Ⅰ～Ⅱ期：24例，Ⅲ～Ⅳ期：36例。有淋巴结转移33例，无淋巴结转移27例。所有患者既往无自体免疫性疾病和其他肿瘤病史，术前未接受放、化疗和免疫治疗。

1.2 试剂和方法 羊抗兔CRKL抗体(C-20)购自美国Santa-cruz公司，产品货号sc-319；羊抗兔Ki67抗体购自武汉博士德公司，产品货号BA2888；DBA试剂盒购自武汉博士德公司。采用免疫组化(SP)法对切片染色，操作严格按照说明书进行。用0.01M PBS代替一抗作为阴性对照，用已知阳性切片作为阳性对照。

1.3 结果判断及评分标准 采用双盲法，由2名高级职称的病理医师独立阅片后判定。CRKL表达主要以细胞浆及极少量联合有细胞核出现淡黄色至棕褐色颗粒为阳性，细胞浆或细胞核不着色或单一细胞核着色为阴性；Ki67表达以细胞核出现淡黄色至棕褐色颗粒为阳性，细胞核不着色或单一细胞浆着色为阴性。

评分标准：参考Kawasaki[4]的方法制定免疫组化半定量积分标准，即阳性细胞数所占百分率计分与染色强度的乘积来进行判断。

1.4 统计学处理 应用SPSS19.0软件，计数资料采用χ2检验，采用Spearman等级相关检验分析CRKL和Ki67的关联状况，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 CRKL和Ki67蛋白在食管癌及正常癌旁组织中的表达情况 CRKL蛋白大多表达于细胞浆，少量联合细胞核表达(图1)，食管癌中阳性表达率为56.7%(34/60)，正常癌旁组织阳性表达率为5.4%(3/56)，两者比较差异有统计学意义(P<0.01)；Ki67蛋白表达于细胞核(图2)，在食管癌中阳性表达率为68.3%(41/60)，正常癌旁组织阳性表达率为9.1%(5/56)，两者差异有统计学意义(P<0.01)。

图1 CRKL蛋白在组织中的表达情况(SP，×200)

2.2 CRKL和Ki67与食管癌临床病理参数的关系 CRKL的表达与食管癌分化程度(P=0.027)、TMN分期(P=0.029)、浸润深度(P=0.049)及淋巴结转移有关(P=0.012)，与患者年龄、性别、肿瘤大小、部位无关(P>0.05)。Ki67表达与肿瘤的TMN分期(P=0.006)、淋巴结转移有关(P=0.028)，与患者年龄、性别、肿瘤大小、部位、分化程度、浸润深度无关(P>0.05)。见表1。

图2 Ki67蛋白在组织中的表达情况(SP，×200)

(n；%)

2.3 CRKL和Ki67在食管癌组织中表达的关系 CRKL蛋白的表达强度随Ki67蛋白表达增强而升高，两者存在正相关(r=0.352，P=0.006，表2)。

表2 食管癌组织CRKL与ki67蛋白表达的关系

3 讨 论

信号传导是将来自细胞外的信号刺激通过一定的机制转换成细胞应答反应，引起细胞增殖、分化、代谢、应激、凋亡的过程等，从而可导致肿瘤的发生。CRKL蛋白是由定位于人染色体22q11.21的CRKL基因所编码的一种信号接头蛋白[5]，其本身不具有酶活性，但能与CBL 、HEF1 、CAS 、paxllin 、C3G 、SOS等结合，参与Ras，JNK， AR、Relinn、β整合素等信号通路。其功能包括：调节细胞增殖、黏附、运动、吞噬、分化、转化和凋亡等[6]，在人类上皮组织中呈现微量表达。目前研究表明，基因突变及调节紊乱在白血病的发生中扮演着重要角色[7]，而CRKL与恶性肿瘤关系的最早研究，即开始于对白血病的研究，并且业已证实其与慢性髓性细胞白血病的发病及病情发展密切相关，并能作为病情预后的判断指标[8]。Hiroko等[9]用全基因组的单核苷酸多态性基因芯片分析法(SNPs)、FISH法、免疫组化法检测出胃癌细胞中CRKL基因和蛋白呈现高表达，指出CRKL基因扩增与蛋白的高表达有相关性，促进了胃癌的发生与发展，并且以CRKL蛋白为靶点可能对胃癌治疗有帮助。WANG等[10]用免疫组化法和WB法检测非小细胞肺癌中CRKL及Ki67表达情况，发现 CRKL蛋白在非小细胞肺癌中明显高表达，并且与Ki67蛋白呈正相关性而参与肿瘤细胞的增殖。另有研究表明，CRKL在头颈部鳞状细胞癌、胶质母细胞瘤、前列腺癌、乳腺癌、横纹肌肉瘤、卵巢癌等多种肿瘤中呈现高表达，并且与肿瘤的分化、TMN分期、淋巴结及远处转移等相关[11，12]。

Ki67蛋白的人类基因定位于染色体10q2.5，是增殖细胞中的一种核抗原[13]，其开始表达于细胞周期的G1期，在S期及G2期表达增加，至M期达到高峰，在G0期及G1早期无表达，是一种检测肿瘤细胞活性的可靠指标。有研究表明，Ki67蛋白与膀胱癌、食管癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、头颈部肿瘤等发病有关，可能与这些肿瘤的发生、发展、分期、浸润、转移、复发和预后等具有相关性[14，15]。

本研究运用SP法对60例食管癌及56例癌旁正常组织中的CRKL和Ki67蛋白进行检测，发现CRKL主要在细胞质中表达，其在食管癌组织中呈现高表达，与癌旁正常组织比较具有明显差异；引入食管癌的临床病理参数后的分析结果显示，CRKL蛋白表达与食管癌的分化程度、TMN分期、浸润深度及淋巴结转移有关，并且随着肿瘤分化程度的降低、TMN分期的增高、浸润深度的加深及淋巴结转移的增加而表达增强。同时发现Ki67蛋白仅表达于细胞核，在食管癌中也呈现高表达，与食管癌的TMN分期、淋巴结转移有关，并随肿瘤TMN分期增高、淋巴结转移的增加而表达增强，和CRKL蛋白的相关性分析证实其与CRKL蛋白表达呈正相关。以上结果表明，CRKL与Ki67参与了食管癌的发生及发展过程，对其检测可有助于判断食管癌的恶性程度。并且，CRKL作为一种关键的信号传导分子，参与了多种信号途径并因此与许多肿瘤的形成与侵袭性有关，目前其具体的作用机制成为研究的热点与难点。本研究通过检测CRKL在食管癌中的表达情况，探讨其与食管癌的关系，将有助于对其具体机制进行深入的研究，同时也为判断食管癌发生、病情进展及临床分子靶向治疗提供了一种新的方向。

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(2013-11-07收稿 2013-12-25修回)

(责任编辑 尤伟杰)

Expressions and clinical significances of CRKL and Ki67 in esophageal cancer

ZHAO Zhi1，XIE Liqun2，LUO Junqing1，JIAN Ming1，and LIU Zhan3.

1. Department of Gastroenterology, Hunan Provincal Corps Hospital of Chinese People’s Armed Police Forces, Changsha 410006, China，2.Department of Gastroenterology，Affiliated Hospital of Logistics University of Chinese People’s Armed Police Forces，Tianjin 300162，China，3.Department of Gastroenterology，Hunan Provincal People’s Hospital, Changsha 410008,China

Objective To study the expressions of CRKL and Ki67 proteins in esophageal cancer and the correlation between expression and clinicopathological features. Methods Immunohistochemistry streptavidin peroxidase (SP) was designed to detect the expression of CRKL and Ki67 proteins in 60 cases of esophageal cancer tissues and 56 cases of nomally adjacent tissues. Results The positive rate of CRKL protein expression in esophageal cancer tissues and nomal controls were 56.7%(34/60)and 5.4%(3/56), respectively; there was significant difference between them(P<0.01).The expression of CRKL protein in esophageal cancer had obvious correlations with degree of differentiation (P=0.027),TMN stages (P=0.029),depth of invasion (P=0.049)and lymphatic matastasis of tumor (P=0.012);and had no correlations with age and sex of patients,size and location of tumor(P>0.05).The positive rates of Ki67 protein in esophageal cancer tissues and nomal controls were 68.3%(41/60) and 9.1%(5/56),respectively;there was significant difference between them(P<0.01). The expression of Ki67 protein in esophageal cancer had obvious correlation with TMN stages (P=0.006)and lymphatic matastasis of tumor (P=0.028); and had no correlation with age,sex, degree of differentiation, depth of invasion,size and location of tumor(P>0.05).The expression of CRKL protein had positive correlation with the expression of Ki67 protein in esophageal cancer tissue(r=0.352，P<0.01). Conclusions CRKL and Ki67 participate in the development process of esophageal cancer and it is advantageous to judge the malignant degree of tumor by detecting their expressions. CRKL can be clinical predictors of esophageal cancer and newly molecular target of clinical treatment.

esophageal cancer；CRKL；Ki67；immunohistochemistry streptavidin peroxidase

赵 智，本科学历，主治医师，E-mail:zhaozjxk2012@163.com

1. 410006长沙，武警湖南总队医院内二科；2. 300162天津，武警后勤学院附属医院消化内科；3. 410008长沙，湖南省人民医院消化内科

谢立群， E-mail: xieliqun66@hotmail.com

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