WY14643对高血压大鼠血管内皮的保护作用

唐 亮，李 健，屈 晨，周月宏，张 曼

WY14643对高血压大鼠血管内皮的保护作用

唐 亮1，李 健1，屈 晨1，周月宏2，张 曼1

目的 观察WY14643对高血压大鼠血管内皮的作用机制。方法 通过将38-42周的自发性高血压大鼠SHR分离获取主动脉，水浴在10 ml的组织浴槽中。随机分为2组，SHR组9只使用蒸馏水处理作为对照，WY14643组10只使用WY14643进行干预，搜集浴槽中的液体，检测血管舒张因子的变化，检测血管组织中内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)的改变。结果 经过WY14643处理后，与SHR组相比，WY14643组 NO( 23.4±3.2) μmol/L和PGI2(前列环素)(413.5±113.6)ng/L的含量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 WY14643对高血压大鼠血管内皮具有保护作用。

高血压大鼠SHR；血管舒张因子；一氧化氮合成酶；前列环素;内皮素

近年来，随着社会环境、人口老龄化及生活习惯的改变，高血压病的发生率越来越高，继而导致各种心脑血管疾病的发生呈增高趋势[1]。研究表明，内皮细胞在高血压病的发生中具有重要作用，血管内皮细胞通过释放血管内皮素，保持其平衡来调节血管的收缩节律。高血压、糖尿病等病理状态下，内皮细胞损伤，使得舒缩因子的平衡被打破，从而导致冠心病等疾病的发生。Van Bilsen[2]提出衰竭心肌代谢重构(metabolic remodeling)的概念后,心肌细胞糖脂利用和能量代谢紊乱被认为参与了冠心病的发生，过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator activated receptor, PPAR)在其中的作用越来越多的被揭示，其广泛的分布于血管内皮及心肌细胞中，PPAR表达下降可能是心肌底物和能量代谢紊乱的基础，有可能是冠心病发病的机制[3]。Wy14643是过氧化物酶体增殖物激活受体双重激动药，它可能对于内皮功能具有保护作用。本研究使用SHR观察Wy14643对血管舒张因子和收缩因子的影响，进一步探讨其对高血压发生过程中内皮功能障碍改善机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 38～42 周的雄性SHR大鼠19只，体重340～380 g，购自北京维通利华实验动物有限公司，清洁条件下喂食标准饲料，自由饮水，饲养于12 h/12 h明暗交替的环境中，温度(21±1)℃。

1.2 试剂 Wy14643(CAS 50892-23-4| 圣克鲁斯生物技术公司)，PGI2 ELISA试剂盒(上海科敏生物科技有限公司,BH4617),EDHFELISA试剂盒(上海蓝基生物科技有限公司，批号E02E0131), ET-1ELISA试剂盒(上海源叶生物科技有限公司，货号：42101)， AngⅡELISA试剂盒(上海武昊经贸有限公司，货号：E90005Ra )，NOS羊多克隆抗体(RSm-2118M，Sigma公司)。

1.3 实验动物分组及主动脉分离 SHR大鼠随机分为SHR组(9只)和Wy14643组(10只)，通过腹腔注射10%的水合氯醛进行麻醉，0.25 ml/100 g，阻断血流或离断血管后10 min内将目标血管获得，立即保存在4℃克-林二氏重碳酸盐缓冲液(pH 7.4)中，NaCl(118 mM),KCl(4.7 mM),MgSO4(2.5 mM),KH2PO4(1.2 mM),CaCl2(2.5 mM),NaHCO3(25 mM) ,葡萄糖(11.1 mM))，加入苯肾上腺素 (1 mM)，刺激血管收缩， Wy14643组使用0.1 nM的Wy14643进行处理，处理时间为20 min，SHR组大鼠使用蒸馏水处理作为对照。

1.4 NO含量测定 用LS55荧光分光光度仪测定已知浓度的N-乙酰半胱氨酸-亚硝基硫醇标准溶液在334/453 nm的荧光强度,制定标准曲线。测定反应体系中加入血管蛋白匀浆前后的荧光强度改变从而计算NO含量。

1.5 ELISA检测PGI2 严格按照各种因子的ELISA试剂盒的说明书进行 操作，具体简述如下：设1孔为空白对照孔( 加100 μl 的蒸馏水)， 设立标准孔8孔，将标准品梯度稀释(0、50、10、25、50、100 μmol/L)各100 μl按照次序分别加入空白微孔中(设立复孔) ，于空白微孔中依次加入各组样品血浆100 μl;每孔中加入第一抗体工作液50 μl，充分混匀后将反应板密封，室温置于摇床 3 h，用洗涤液将反应板充分洗涤4～6次，每孔加酶标抗体工作液(Anti-Rabbit IgG)100 μl，充分混匀将反应板密封，置于室温1 h，用洗涤液将反应板充分洗涤4～6次，每孔中加入底物工作液100 μl, 置于37 ℃暗处反应30 min，每孔中加入50 μl终止液混匀，用酶标仪在450 nm处测吸光值，制作标准曲线，并计算数值[4]。

1.6 Westernblor检测eNOS的表达 取-70 ℃ 保存的血管组织 50 mg 采用RIPA裂解液(碧云天生物公司)提取总蛋白，取样品10 μl采用考马斯亮蓝法测定总蛋白浓度，取40 μg总蛋白上样，经12%的分离胶电泳分离蛋白，半干转印至PVDF膜上， 5%脱脂奶粉室温封闭1 h，洗膜后分别与抗NOX抗体(1∶600，Sigma )和抗β -actin 的抗体(1∶1000 ，Sigma ) 4 ℃ 杂交过夜，然后与辣根过氧化物酶标记的对应二抗室温杂交2 h， ECL化学发光系统检测反应产物信号。 每个标本重复3次，以β -actin为内参进行相对定量分析。

2 结 果

2.1 WY14643对高血压大鼠NO和PGI2的影响 SHR组NO 含量(5.4±1.6) μmol/L, PGI2含量(27.3±5.6) ng/L。 WY14643组经过WY14643处理后， NO含量(23.4±3.2)μmol/L、 PGI2含量(413.5±113.6)ng/L。与SHR组相比明显升高，差异具有统计学意义(P<0.01)。

2.2 WY14643对高血压大鼠eNOS的影响 取-70 ℃保存的血管组织，用Westrnblot检测两组血管组织中eNOS的表达，Westrnblot结果显示WY14643组血管中eNOS(内皮型一氧化氮合酶)的蛋白表达明显高于SHR组(P<0.05，图1)。

图1 WY14643组大鼠的血管中eNOS明显升高

3 讨 论

自从提出衰竭心肌代谢重构的概念后，越来越多的证据支持心肌细胞糖脂利用和能量代谢紊乱导致心肌重构，最终导致充血性心力衰竭(congestive heart failure，CHF)的发生和发展。近年来，学者们逐渐认识到代谢性核受体，尤其是PPAR是正常生理代谢和慢性代谢性疾病发病机制的关键环节。代谢性核受体是心肌代谢的节点，在心肌代谢中尤为重要的是PPAR。许多糖脂代谢酶蛋白均是PPAR的靶基因。CHF患者心肌PPAR表达下降可能是心肌底物和能量代谢紊乱的基础。PPAR广泛存在于血管内皮及心肌细胞中[1]。

CHF患者心肌组织PPAR亚型α的表达较正常供体心脏组织下降54%。由此推断PPAR α受损可能参与CHF的发生发展,目前菲诺贝特已作为PPAR 亚型α激动药被广泛临床应用。冠心病、高血压及慢性心功能不全患者体内交感的激活早已成为定论，血和组织儿茶酚胺水平增加将导致脂肪细胞中三酰甘油分解增加，使得血游离脂肪酸水平增加，成为导致心肌胰岛素抵抗的主要机制。过氧化物酶体增殖物激活受体激动剂亚型γ已被广泛应用作为胰岛素增敏剂，增加细胞对胰岛素的利用。

PPAR亚型α和亚型γ的双重激动药WY14643是通过干预血管内皮收缩因子的释放来调节内皮的损伤与修复[5]。在高血压状态下，大鼠的血管内皮释放出的血管收缩因子，使得疾病进一步加重，导致了一个恶性的循环模式[6]。血脂及血糖的异常可以引起动脉粥样硬化斑块形成已被临床证实，但PPAR双重激动药Wy14643除调整血糖及血脂外对高血压的干预的相关机制还不明确。血管内皮收缩因子的产生是通过环氧化酶介导的[7]。本研究结果显示，经过WY14643处理后的SHR大鼠血管，NO和PGI2的含量明显升高，在生理情况下血管内皮细胞可产生血管内皮素，如血管收缩因子和舒张因子并保持其平衡，从而可以调节血管的收缩与舒张，NO和PGI2经过大量研究证明都是血管舒张因子，可以增强血管的舒张功能。尤其是NO可以通过细胞膜迅速传递，并可以达到血管平滑肌细胞，使平滑肌松弛，从而动脉血管扩张，以完成调节血压和血流分布的作用。也有研究证实，内源性NO不仅有血管舒张功能，还能调节血管内皮的生长[8]，触发血管活性物质的释放，促进血管生长与再生，对血管起到保护作用。本研究还发现，大鼠血管eNOS(内皮型一氧化氮合酶)的表达也明显升高，eNOS的升高，促使NO合成的增加，起到血管舒张及血管保护作用[9]，从而进一步印证了WY14643对血管内皮的保护作用。WY14643通过对过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)亚型α和亚型γ的作用，促使血管内皮产生更多的eNOS，使NO的表达增加，同时也使PGI2的含量明显升高，它们对血管内皮共同起到保护作用[10]。

综上所述，应用PPAR双重激动药WY14643能改善血管内皮收缩，血管内皮收缩是高血压的独立风险因素，减少血管内皮收缩是降低血压的方式之一，也表明PPAR双重激动药WY14643是提高血管内皮功能的有效药物。

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(2013-10-26收稿 2013-12-20修回)

(责任编辑 郭 青)

Effect of WY14643 on vascular endothelial function in hypertensive rats

TANG Liang1, LI Jian1, QU Chen1, ZHOU Yuehong2, and ZHANG Man1.

1.Department of Cardiology,2. Department of Endocrinology, Central Hospital Attached to Shenyang Medical College, Shenyang 110024,China

Objective To observe the effect of WY14643 on vascular endothelium in rats with hypertension. Methods We selected spontaneous hypertensive rats(SHR) of 38-42 weeks, isolated the aorta and bathed it in 10 ml tissue bath. We randomly divided them into 2 groups: rats of SHR group was just treated with distilled water as control group, 10 rats of WY14643 group was only treated with WY14643 as intervention group.The liquid in bath was collected to detect the changes of vasodilator and eNOS in vascular tissue. Results NO and PGI2(prostacyclin) levels and eNOS(nitric oxide synthase) expression were significantly increased after WY14643 treatment.There was a statistically significant difference (P<0.05) between the two groups. Conclusions WY14643 plays a protective role on vascular endothelium in rats with hypertension.

SHR hypertension rats；vasodilatation factors；nitric oxide synthetase; prostacyclin；endothelin

沈阳医学院青年基金支持项目(20122029)

唐 亮，硕士，主治医师，E-mail: hannash@eyou.com

120001,沈阳医学院附属中心医院:1.循环科，2.内分泌科

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