野葛藤地上部分挥发油成分分析和抗氧化活性研究

仰玲玲+吴向阳+仰榴青

摘要：对茅山地区野葛藤的挥发成分进行了初步分析和抗氧化活性研究，采用水蒸气蒸馏-乙醚萃取法对野葛藤进行提取，用GC/MS对其挥发成分进行初步分析，并用DPPH法、邻二氮菲法和邻苯三酚自氧化法研究了葛藤挥发油清除自由基活性。得出结果：葛藤分离出的153个组分中可鉴定组分64个，其中主要以烷酸和烯酸类化合物为主；且挥发油都具有良好的清除自由基活性。

关键词：野葛藤； 挥发油； 水蒸气蒸馏-乙醚萃取法； GC/MS； 抗氧化活性

中图分类号： R284.1文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）02-0268-04

收稿日期：2013-07-07

作者简介：仰玲玲（1983—），女，安徽巢湖人，硕士，讲师，主要从事食品工艺与检测。E-mail：foodwhat605b@aliyun.com。

通信作者：吴向阳，博士，教授，主要从事生物资源高效利用研究。E-mail：wuxy@ujs.edu.cn。野葛[Puerariae lobata （Wild） Ohwi]为豆科多年生落叶藤本植物，广泛分布在茅山地区。中国药典收载的葛根系野葛的干燥根，其药用最早记载于《神农本草经》。现代药理研究证实，葛根具有显著的扩张冠状动脉、增加冠脉血流量、降低血压及血管阻力、抗心律失常、抗氧化作用、提高学习记忆功能等多种药理作用[1]。另外，近年来研究发现野葛的其他部位，如葛藤（葛藤茎和葛叶）、葛花，也具有类似的药理活性。目前我国野葛的研究和开发都集中在葛根与葛花[2]部位，而对葛藤部位的分析主要为异黄酮类成分，对其他化学成分的分析以及生物活性的研究少。本研究分别利用水蒸气蒸馏-乙醚萃取法对野葛藤进行提取，并对所得成分进行初步分析和抗氧化活性研究，以期为葛藤的开发利用提供科学依据。

1材料与方法

1.1主要材料与试剂

野葛藤样品，2007年10月采集于江苏省茅山地区，60 ℃烘干，粉碎，过60目筛，贮存于干燥器中备用。5%苯酚溶液的配制：取苯酚100 g，加铝片0.1 g和碳酸氢钠0.05 g，蒸馏，收集182℃馏分，称取10 g，加水溶解并稀释至200.0 mL，摇匀，置棕色瓶内，放冰箱中备用。

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH·）（美国Sigma公司）；邻二氮菲和苯丙三酚（国药集团化学试剂有限公司）；95%医用乙醇；其余试剂均为分析纯；所有用水均为双蒸水。

1.2主要仪器与设备

气相色谱-质谱联用仪，配有6890N 色谱仪、5975B VL MSD和HP7683全自动进样器（美国Agilent公司）；电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；旋转蒸发仪RE-52C（巩义市予华仪器有限责任公司）。

1.3试验方法

1.3.1葛藤挥发油的提取准确称取葛藤茎叶50 g，置于 2 000 mL 圆底蒸馏烧瓶中，加入500 mL蒸馏水，用挥发油提取器进行提取，时间为12 h，蒸出液用乙醚萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，乙醚自然挥发干，得到金黄色挥发油0.2011 g。

1.3.2挥发油成分分析

1.3.2.1供试样品的制备 取一定量的挥发油，加入甲酯化试剂（10 mL浓H2SO4缓慢倒入90 mL CH3OH中，搅匀，待冷却加入100 mL苯）3.0 mL，室温下反应24 h；加入1.0 mL苯和0.5 mL饱和NaCl溶液，充分搅拌，离心5 min，静置，取上清液备用。

1.3.2.2GC-MS分析条件气相色谱条件：DB-1石英毛细管柱（30 m×0.25 mm，膜厚0. 25 μm）；载气He，载气流量1.50 mL/ min；柱温75～220 ℃；程序升温：初始温度为 75 ℃，保持3 min后以8 ℃/min的速率升至220 ℃，保持 5 min；气化室温为260 ℃；分流比为25 ∶1。质谱条件：EI离子源；离子源温度230 ℃；电子能量70 eV；接口温度250 ℃；质量扫描范围35～540 u。

1.3.3 抗氧化活性试验

1.3.3.1 清除DPPH·自由基试验[3-4]利用分光光度法测定DPPH·的清除率，测定波长为524 nm。分别取2 mL不同浓度的以80%乙醇为溶剂的样品液于试管中，加入2 mL 0.2 mmol/L 的DPPH·溶液（以无水乙醇配制），混合均匀，暗处反应30 min后于524 nm处测定其吸光度D524 nm，以溶剂80%乙醇代替样品液测得空白吸光度D0，重复3次。清除率按下式计算：

清除率S=（D0-D524 nm）/D0×100%

1.3.3.2清除羟自由基（·OH）试验[5]取1 mL 0.75 mmol/L 邻二氮菲无水乙醇溶液于试管中，依次加入 2 mL 0.2 mol/L pH值7.40磷酸盐缓冲溶液和1 L蒸馏水，充分混匀后，加入1 mL 0.75 mmol/L硫酸亚铁溶液（FeSO4）混匀，再加入1 mL 0.01%双氧水（H2O2），于37 ℃水浴60 min，在536 nm处测其吸光度，所测得的数据为损伤管的吸光度D损；以1 mL样品液代替1 mL蒸馏水测得样品的吸光度D样；用1 mL蒸馏水代替1 mL双氧水测得的吸光度为D未。重复3次。清除率按下式计算：

清除率S=（D样-D损）/（D未-D损） ×100%

1.3.3.3清除超氧自由基（ O-2· ）试验[6]取9 mL 0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液（pH值8.2）与1 mL样品液混合，25 ℃ 恒温水浴15 min。取3 mL混合液于比色皿中，加入 0.1 mL 的45 mmol/L邻苯三酚，摇匀，在第4分钟加入 10 mol/L 盐酸1滴终止反应，于325 nm处测定样品吸光度D1，同时分别测定不加邻苯三酚的样品液和磷酸盐混合液的吸光度D2和以1 mL溶剂代替样品液的磷酸盐和邻苯三酚混合液的吸光度D3，重复3次。 O-2· 清除率按下式计算：endprint

清除率S=[1-（D1-D2）/D3] ×100%

2结果与分析

2.1葛藤挥发油成分分析

用水蒸气蒸馏法提取葛藤挥发油201.1 mg，出油率为0402%。利用毛细管色谱对其挥发油成分进行了分析，化学工作站给出总离子流色谱图（图1）。利用气-质联用技术对它进行总离子质谱检测，采用计算机对各峰质谱图进行标准谱库的检索并结合质谱裂解规律，从153个峰中鉴定出64个组分，占挥发油总量的91.17%。利用峰面积归一化计算各组分的相对含量。分析鉴定结果见表1。

从表1可知，成功鉴定出的64种化合物中：醇类化合物（7个，见表1中序号14、22、44、54、55、58、60）占总量的522%；酮类化合物（2个，见表1中序号25、38）占4.41%；烯烃类化合物（3个，见表1中序号22、34、57）占0.65%；烷烃类化合物（3个，见表1中序号7、10、21）占0.12%；醛类化合物（6个，见表1中序号2、8、11、13、15、59）占0.32%；烷酸和烯酸类化合物（31个，烷酸见表1中序号1、6、9、12、16、19、23、28～31、35、36～37、41～43、46～47、49、53、61，烯酸见表1中序号3、27、40、48、52～53、56、62～63）占69.72%；芳烃类化合物（4个，见表1中序号5、18、20、50）占0.65%；酯类化合物（5个，见表1中序号4、17、33、45、64）占3.55%；其他化合物（1个，见表1中序号39）占1.35%。

从分析结果可以看出，葛藤挥发油中主要化学成分为： 2-甲基-Z，Z-3，13-十八碳二烯醇，植酮、壬二酸、十二烷酸、肉豆蔻酸、十五烷酸、十六烷酸、十七烷酸、十八烷酸、（Z）-9-十八烯酸、10，13-十六二烯酸、11-十八碳烯酸、8-（2-呋喃）辛酸酯、2-戊酸十四酯、9-十八炔，其中主要以烷酸和烯酸类化合物为主。

2.2抗氧化活性试验

2.2.1清除DPPH·自由基效果图2和图3分别为挥发油和维生素C对DPPH·的清除效果。可以看出，挥发油对DPPH·具有清除作用，清除率随着提取物浓度的增加而增大。挥发油对DPPH·自由基的半清除率（IC50）值为 3.3011 mg/mL，其清除DPPH·能力弱于维生素C（0.009 1 mg/mL）。

2.2.2清除羟基自由基（·OH）效果图4和图5分别为挥发油和维生素C对·OH的清除效果。可以看出，挥发油对·OH有一定的清除作用，且清除率随着浓度的增加而增大，当浓度为4 mg/mL时，挥发油的清除率为72.48%。挥发油对·OH自由基的半清除率IC50值为3.075 5 mg/mL，其清除·OH能力弱于维生素C（0.347 7 mg/mL）。

2.2.3清除超氧自由基（ O-2· ）效果图6和图7分别为挥发油和维素C对 O-2· 的清除效果，可见挥发油在3 mg/mL的清除率达到64.39%。挥发油的IC50值为2.342 4 mg/mL，其清除率低于维素C（0.229 9 mg/mL）。

3讨论与结论

采用硫酸催化甲酯化衍生化方法，对野葛藤挥发油进行了GC-MS分析，鉴定出64种化合物，其中醇类化合物（7个）占总量的5.22%；酮类化合物（2个）占4.41%；烯烃类化合物（3个）占0.65%；烷烃类化合物（3个）占0.12%；

醛类化合物（6个）占0.32%；酸类化合物（31个）占6972%；芳烃类化合物（4个）占0.65%；酯类化合物（4个）占3.55%；其他化合物（1个）占1.35%。

本研究通过清除DPPH·自由基能力、清除羟自由基能力、清除超氧阴离子能力3个方面试验，并与维生素C进行比较，得出较为客观的结论：野葛藤挥发油对3种自由基（DPPH·、·OH、 O-2· ）均有较好的清除作用，可开发为天然抗氧化剂。

参考文献：

[1]赵亮，潘显道，朱承根. 葛根黄酮的研究进展[J]. 医学研究通讯，2004，33（11）：33-35.

[2]周艳晖，岑颖洲，李药兰，等. 广东连南地区野葛花挥发油成分的GC-MS分析[J]. 暨南大学学报：自然科学与医学版，2004，25（3）：381-385.

[3]Liyana-Pathirana C M，Shahidi F. Antioxidant and free radical scavenging activities of whole wheat and milling fractions[J]. Food Chemistry，2007，101（3）： 1151-1157.

[4]许申鸿，杭瑚. 葡萄籽和葡萄片清除自由基作用的研究[J]. 食品科学，1999（12）：28-30.

[5]于立梅，赵谋明，崔春，等. 山竹壳中原花青素提取分级及抗氧化活性的研究[J]. 食品与机械，2007，23（4）：60-64.

[6]Ouettier-Deleu C，Gressier B，Vasseur J，et al. Phenolic compounds and antioxidant activities of buckwheat（Fagopyrum esculentum Moench） hulls and flour[J]. Journal of Ethnopharmacology，2000，72（1/2）： 35-42.endprint

清除率S=[1-（D1-D2）/D3] ×100%

2结果与分析

2.1葛藤挥发油成分分析

用水蒸气蒸馏法提取葛藤挥发油201.1 mg，出油率为0402%。利用毛细管色谱对其挥发油成分进行了分析，化学工作站给出总离子流色谱图（图1）。利用气-质联用技术对它进行总离子质谱检测，采用计算机对各峰质谱图进行标准谱库的检索并结合质谱裂解规律，从153个峰中鉴定出64个组分，占挥发油总量的91.17%。利用峰面积归一化计算各组分的相对含量。分析鉴定结果见表1。

从表1可知，成功鉴定出的64种化合物中：醇类化合物（7个，见表1中序号14、22、44、54、55、58、60）占总量的522%；酮类化合物（2个，见表1中序号25、38）占4.41%；烯烃类化合物（3个，见表1中序号22、34、57）占0.65%；烷烃类化合物（3个，见表1中序号7、10、21）占0.12%；醛类化合物（6个，见表1中序号2、8、11、13、15、59）占0.32%；烷酸和烯酸类化合物（31个，烷酸见表1中序号1、6、9、12、16、19、23、28～31、35、36～37、41～43、46～47、49、53、61，烯酸见表1中序号3、27、40、48、52～53、56、62～63）占69.72%；芳烃类化合物（4个，见表1中序号5、18、20、50）占0.65%；酯类化合物（5个，见表1中序号4、17、33、45、64）占3.55%；其他化合物（1个，见表1中序号39）占1.35%。

从分析结果可以看出，葛藤挥发油中主要化学成分为： 2-甲基-Z，Z-3，13-十八碳二烯醇，植酮、壬二酸、十二烷酸、肉豆蔻酸、十五烷酸、十六烷酸、十七烷酸、十八烷酸、（Z）-9-十八烯酸、10，13-十六二烯酸、11-十八碳烯酸、8-（2-呋喃）辛酸酯、2-戊酸十四酯、9-十八炔，其中主要以烷酸和烯酸类化合物为主。

2.2抗氧化活性试验

2.2.1清除DPPH·自由基效果图2和图3分别为挥发油和维生素C对DPPH·的清除效果。可以看出，挥发油对DPPH·具有清除作用，清除率随着提取物浓度的增加而增大。挥发油对DPPH·自由基的半清除率（IC50）值为 3.3011 mg/mL，其清除DPPH·能力弱于维生素C（0.009 1 mg/mL）。

2.2.2清除羟基自由基（·OH）效果图4和图5分别为挥发油和维生素C对·OH的清除效果。可以看出，挥发油对·OH有一定的清除作用，且清除率随着浓度的增加而增大，当浓度为4 mg/mL时，挥发油的清除率为72.48%。挥发油对·OH自由基的半清除率IC50值为3.075 5 mg/mL，其清除·OH能力弱于维生素C（0.347 7 mg/mL）。

2.2.3清除超氧自由基（ O-2· ）效果图6和图7分别为挥发油和维素C对 O-2· 的清除效果，可见挥发油在3 mg/mL的清除率达到64.39%。挥发油的IC50值为2.342 4 mg/mL，其清除率低于维素C（0.229 9 mg/mL）。

3讨论与结论

采用硫酸催化甲酯化衍生化方法，对野葛藤挥发油进行了GC-MS分析，鉴定出64种化合物，其中醇类化合物（7个）占总量的5.22%；酮类化合物（2个）占4.41%；烯烃类化合物（3个）占0.65%；烷烃类化合物（3个）占0.12%；

醛类化合物（6个）占0.32%；酸类化合物（31个）占6972%；芳烃类化合物（4个）占0.65%；酯类化合物（4个）占3.55%；其他化合物（1个）占1.35%。

本研究通过清除DPPH·自由基能力、清除羟自由基能力、清除超氧阴离子能力3个方面试验，并与维生素C进行比较，得出较为客观的结论：野葛藤挥发油对3种自由基（DPPH·、·OH、 O-2· ）均有较好的清除作用，可开发为天然抗氧化剂。

参考文献：

[1]赵亮，潘显道，朱承根. 葛根黄酮的研究进展[J]. 医学研究通讯，2004，33（11）：33-35.

[2]周艳晖，岑颖洲，李药兰，等. 广东连南地区野葛花挥发油成分的GC-MS分析[J]. 暨南大学学报：自然科学与医学版，2004，25（3）：381-385.

[3]Liyana-Pathirana C M，Shahidi F. Antioxidant and free radical scavenging activities of whole wheat and milling fractions[J]. Food Chemistry，2007，101（3）： 1151-1157.

[4]许申鸿，杭瑚. 葡萄籽和葡萄片清除自由基作用的研究[J]. 食品科学，1999（12）：28-30.

[5]于立梅，赵谋明，崔春，等. 山竹壳中原花青素提取分级及抗氧化活性的研究[J]. 食品与机械，2007，23（4）：60-64.

[6]Ouettier-Deleu C，Gressier B，Vasseur J，et al. Phenolic compounds and antioxidant activities of buckwheat（Fagopyrum esculentum Moench） hulls and flour[J]. Journal of Ethnopharmacology，2000，72（1/2）： 35-42.endprint

清除率S=[1-（D1-D2）/D3] ×100%

2结果与分析

2.1葛藤挥发油成分分析

用水蒸气蒸馏法提取葛藤挥发油201.1 mg，出油率为0402%。利用毛细管色谱对其挥发油成分进行了分析，化学工作站给出总离子流色谱图（图1）。利用气-质联用技术对它进行总离子质谱检测，采用计算机对各峰质谱图进行标准谱库的检索并结合质谱裂解规律，从153个峰中鉴定出64个组分，占挥发油总量的91.17%。利用峰面积归一化计算各组分的相对含量。分析鉴定结果见表1。

从表1可知，成功鉴定出的64种化合物中：醇类化合物（7个，见表1中序号14、22、44、54、55、58、60）占总量的522%；酮类化合物（2个，见表1中序号25、38）占4.41%；烯烃类化合物（3个，见表1中序号22、34、57）占0.65%；烷烃类化合物（3个，见表1中序号7、10、21）占0.12%；醛类化合物（6个，见表1中序号2、8、11、13、15、59）占0.32%；烷酸和烯酸类化合物（31个，烷酸见表1中序号1、6、9、12、16、19、23、28～31、35、36～37、41～43、46～47、49、53、61，烯酸见表1中序号3、27、40、48、52～53、56、62～63）占69.72%；芳烃类化合物（4个，见表1中序号5、18、20、50）占0.65%；酯类化合物（5个，见表1中序号4、17、33、45、64）占3.55%；其他化合物（1个，见表1中序号39）占1.35%。

从分析结果可以看出，葛藤挥发油中主要化学成分为： 2-甲基-Z，Z-3，13-十八碳二烯醇，植酮、壬二酸、十二烷酸、肉豆蔻酸、十五烷酸、十六烷酸、十七烷酸、十八烷酸、（Z）-9-十八烯酸、10，13-十六二烯酸、11-十八碳烯酸、8-（2-呋喃）辛酸酯、2-戊酸十四酯、9-十八炔，其中主要以烷酸和烯酸类化合物为主。

2.2抗氧化活性试验

2.2.1清除DPPH·自由基效果图2和图3分别为挥发油和维生素C对DPPH·的清除效果。可以看出，挥发油对DPPH·具有清除作用，清除率随着提取物浓度的增加而增大。挥发油对DPPH·自由基的半清除率（IC50）值为 3.3011 mg/mL，其清除DPPH·能力弱于维生素C（0.009 1 mg/mL）。

2.2.2清除羟基自由基（·OH）效果图4和图5分别为挥发油和维生素C对·OH的清除效果。可以看出，挥发油对·OH有一定的清除作用，且清除率随着浓度的增加而增大，当浓度为4 mg/mL时，挥发油的清除率为72.48%。挥发油对·OH自由基的半清除率IC50值为3.075 5 mg/mL，其清除·OH能力弱于维生素C（0.347 7 mg/mL）。

2.2.3清除超氧自由基（ O-2· ）效果图6和图7分别为挥发油和维素C对 O-2· 的清除效果，可见挥发油在3 mg/mL的清除率达到64.39%。挥发油的IC50值为2.342 4 mg/mL，其清除率低于维素C（0.229 9 mg/mL）。

3讨论与结论

采用硫酸催化甲酯化衍生化方法，对野葛藤挥发油进行了GC-MS分析，鉴定出64种化合物，其中醇类化合物（7个）占总量的5.22%；酮类化合物（2个）占4.41%；烯烃类化合物（3个）占0.65%；烷烃类化合物（3个）占0.12%；

醛类化合物（6个）占0.32%；酸类化合物（31个）占6972%；芳烃类化合物（4个）占0.65%；酯类化合物（4个）占3.55%；其他化合物（1个）占1.35%。

本研究通过清除DPPH·自由基能力、清除羟自由基能力、清除超氧阴离子能力3个方面试验，并与维生素C进行比较，得出较为客观的结论：野葛藤挥发油对3种自由基（DPPH·、·OH、 O-2· ）均有较好的清除作用，可开发为天然抗氧化剂。

参考文献：

[1]赵亮，潘显道，朱承根. 葛根黄酮的研究进展[J]. 医学研究通讯，2004，33（11）：33-35.

[2]周艳晖，岑颖洲，李药兰，等. 广东连南地区野葛花挥发油成分的GC-MS分析[J]. 暨南大学学报：自然科学与医学版，2004，25（3）：381-385.

[3]Liyana-Pathirana C M，Shahidi F. Antioxidant and free radical scavenging activities of whole wheat and milling fractions[J]. Food Chemistry，2007，101（3）： 1151-1157.

[4]许申鸿，杭瑚. 葡萄籽和葡萄片清除自由基作用的研究[J]. 食品科学，1999（12）：28-30.

[5]于立梅，赵谋明，崔春，等. 山竹壳中原花青素提取分级及抗氧化活性的研究[J]. 食品与机械，2007，23（4）：60-64.

[6]Ouettier-Deleu C，Gressier B，Vasseur J，et al. Phenolic compounds and antioxidant activities of buckwheat（Fagopyrum esculentum Moench） hulls and flour[J]. Journal of Ethnopharmacology，2000，72（1/2）： 35-42.endprint