环介导等温扩增技术快速检测金黄色葡萄球菌

张涛涛+王兰+龚频+陈福欣

摘要：研究了用环介导等温扩增技术（LAMP）快速检测金黄色葡萄球菌的方法。首先根据金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因nuc中的保守序列设计特异性引物，建立并优化反应条件，然后通过对金黄色葡萄球菌及其他菌种的对比试验，验证引物的特异性并确定方法的检测限。结果表明：在用加环引物的条件下，LAMP反应体系于60 ℃反应 35 min 即可扩增成功，而用未加环的引物则需45 min才能看到白色絮状沉淀。对2株金黄色葡萄球菌、3株大肠杆菌、1株醋酸杆菌、1株沙门氏菌进行同步检测，结果发现2株金黄色葡萄球菌均显示阳性，而其他菌株均显示阴性。研究确定了LAMP检测纯培养的金黄色葡萄球菌的最低检测限为100 fg，比PCR的最低检测限低2个数量级。由研究结果可以看出，LAMP法检测金黄色葡萄球菌操作简便，有较高的特异性、灵敏度，为快速检测食品中的致病菌提供了较好的技术平台。

关键词：环介导等温扩增技术；金黄色葡萄球菌；耐热核酸酶基因nuc；快速检测

中图分类号：TS207.4文献标志码：A文章编号：1002-1302（2014）02-0238-03

收稿日期：2013-06-27

项目基金：陕西省自然科学基金（编号：2012JQ2011）；陕西省教育厅自然科学基金（编号：12JK0712、12JK0623）；西安市未央区项目（编号：201112、201209）。

作者简介：张涛涛（1984—），女，山西孝义人，硕士研究生，主要从事食品安全快速检测技术的研究。E-mail：ztt2008523220302@126.com。

通信作者：王兰，女，教授，主要从事药物与功能性食品研究工作。E-mail：wanglan1963@126.com。金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是食品中的三大致病菌之一[1]，在自然界中广泛存在。随着抗生素的广泛使用，出现了大量的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，这些金黄色葡萄球菌均可以产生导致人们食物中毒的SEs、TSST等毒力因子[2]。据美国疾病控制中心显示，美国在近年来由于金黄色葡萄球菌而导致的食品中毒事件占33%，居世界第二位[3]，而我国由金黄色葡萄球菌引起的食品中毒事件更是屡见不鲜。

目前我国对于金黄色葡萄球菌包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的检测方法以微生物培养法为主，但其检测时间长、灵敏度相对不高；而传统的核酸扩增技术，如PCR、实时PCR及链置换扩增法等，虽然检测时间相对较短，但在实际操作中仍然存在仪器昂贵、误差大等诸多缺陷[4]，从而限制了这些传统的检测技术在基层的广泛推广。因此，目前亟需建立一种高效、快速且特异性强、灵敏度高的检测方法。

环介导等温扩增方法（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一种由日本科学家Notomi开发的新型核酸扩增技术，其原理是在Bst酶作用下进行的一种自动式链置换合成DNA的反应[5]。LAMP法在65 ℃左右的恒温条件下反应约50 min即可明显观察到白色絮状沉淀，相比PCR技术，无需DNA变性，不需要长时间的热循环及电泳检测，是一种高效、特异性强、灵敏度高的分子检测技术。张琳等将LAMP结合荧光技术应用于IBV病毒检测[6]，李永刚等对金黄色葡萄球菌的产肠毒素基因fem进行了检测[7]，唐梦君等以金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶nuc基因作为靶基因设计了2对引物，即外引物、内引物[8]。本研究以金黄色葡萄球菌的nuc基因为靶基因设计了3对特异性引物，即外引物、内引物、环引物，在此基础上进行LAMP反应条件的优化，并进行引物的特异性鉴定及检测限的确定。

1材料与方法

1.1主要仪器与试剂

主要仪器有PCR扩增仪（MJ Research），凝胶成像系统，冷冻高速离心机，DDC-10C型电泳仪（北京君意东方电泳设备有限公司），水浴锅等。

主要生化试剂有Bst聚合酶，Taq聚合酶，dNTPs，DNA marker等，均购自宝生物工程（大连）有限公司；无水乙醇购自天津天力化学试剂有限公司；培养基牛肉膏、酵母膏、蛋白胨等均购自北京奥博星生物技术有限公司。

1.2试验菌种

金黄色葡萄球菌（ATCC14458）、酿脓链球菌（ATCC19615）、沙门氏菌（ATCC14028）由中国普通微生物菌种保藏中心提供；金黄色葡萄球菌（ATCC25923）、大肠杆菌（ATCC35218）由中国药品生物制品检定所提供；大肠杆菌（CMCC44752）由中国医学细菌保藏管理中心提供；大肠杆菌（O157：H7）为实验室保藏。

1.3引物的设计与合成

根据GenBank中公布的金黄色葡萄球菌nuc基因的保守序列，采用引物设计软件Primer Explore 3.0进行引物设计，筛选得到一套引物，包括外引物、内引物、环引物，详见表1。设计完成后委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4DNA的提取

1.5LAMP扩增及条件的优化

1.6LAMP特异性试验

本试验选取金黄色葡萄球菌（ATCC14458）、金黄色葡萄球菌（ATCC25923）、大肠杆菌（ATCC35218）、大肠杆菌（CMCC44752）、大肠杆菌（O157：H7）、酿脓链球菌（ATCC19615）、沙门氏菌（ATCC14028）作为LAMP研究对象，用以评价金黄色葡萄球菌nuc基因引物的特异性。

1.7LAMP灵敏度试验

将本试验提取的金黄色葡萄球菌（ATCC14458）DNA用生理盐水稀释10倍及以上，并用蒸馏水作为阴性对照，观察LAMP检测金黄色葡萄球菌的最低检测限。

2结果与分析endprint

2.1LAMP检测结果

本研究以金黄色葡萄球菌的nuc基因来设计特异性引物并进行LAMP 扩增检测，其扩增结果见图1，可以看出金黄色葡萄球菌的nuc基因用LAMP扩增后出现典型的梯状条带，而以蒸馏水代替DNA的阴性对照未出现梯状条带。另外发现，在扩增完成并且离心后，EP管底部出现白色沉淀，而阴性对照组未出现白色沉淀。

2.2LAMP检测条件优化结果

2.2.1LAMP反应温度应用建立的LAMP方法，在其他条件不变的情况下对反应温度进一步优化。如图2所示，泳道

5、7出现明显的梯状条带，而其余温度的没有扩增成功，说明该反应的最适反应温度为60 ℃。

2.2.2LAMP反应时间从图3可以看出：在其他条件不变的情况下，不同反应时间对扩增有影响，当反应时间为35 min时即开始扩增，且在45 min时出现了明显的梯状条带。

2.2.3LAMP引物图4表明：加入环引物与否并不影响LAMP 的成功扩增，但是加入环引物的LAMP扩增速率明显比未加环引物的扩增速率高（表1），加环引物的扩增只需 35 min，而未加环引物的需要45 min才可见到絮状沉淀，说明加环引物能加快LAMP的反应速率。

2.3LAMP检测特异性试验结果

应用上述试验建立并优化的LAMP反应条件，针对2株金黄色葡萄球菌、3株大肠杆菌、1株醋酸杆菌及1株沙门氏菌进行检测，结果显示：只有金黄色葡萄球菌显示阳性，而其余菌均显示阴性。说明本试验中根据金黄色葡萄球菌的nuc基因设计的引物具有较高的特异性。

2.4LAMP检测限试验结果

针对提取的DNA模板进行梯度稀释，即分别稀释为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的浓度。结果表明：阴性对照没有梯状条带出现，且LAMP检测的最低限度为 100 fg，较PCR有较高的检测限。

3结论

引物设计是LAMP法的关键，若引物质量不好，容易使引物间形成小于100 bp的聚合物[9]。本研究以金黄色葡萄球菌的nuc基因作为靶基因，并据该基因的6个位点设计引物，增加了扩增的特异性。针对所检测的菌种，仅有金黄色葡萄球菌显示阳性，而其余菌种均显示阴性，说明本研究设计的引物有较好的特异性。

BstDNA聚合酶大片段是分离于嗜热脂肪芽孢杆菌的DNA聚合酶的一部分，具有5′-3′核酸外切酶的活性[10]，不仅需要在高浓度的Mg2+环境下反应，而且温度不宜超过 70 ℃，以免使其失去活性。在本试验中，60 ℃时扩增效果最好，可能由于温度低于60 ℃时，酶的活性没有被激活，而温度到70 ℃时，酶的活性已经失去，因此未能扩增成功。

对于反应中加入环引物与未加环引物的研究，由本试验可知：加入环引物仅需30min即可看到白色絮状沉淀，而未加入环引物要45 min才可以看到沉淀。这与梁磊研究的加环引物的比未加环引物的提前1/3看到白色沉淀是一致的[11]，而且同Nagamine 等研究的加入环引物可以使反应时间缩短30%～50%的结果[12]一致。

LAMP是一种经济、快速、准确、灵敏的分子检测技术，已经被广泛应用于诸多领域，但是在国内较少应用于食品质量检测方面，可能由于筛选合适的引物比较困难。随着研究的不断深入，相信LAMP技术会很快普及到食品安全检测领域。

参考文献：

[1]高涛. 食品中金黄色葡萄球菌肠毒素及检测方法的研究进展[J]. 福建分析测试，2003，12（2）：39-42.

[2]Udo E E，Al-Mufti S，Albert M J. The prevalence of antimicrobial resistance and carriage of virulence genes in Staphylococcus aureus isolated from food handlers in Kuwait City restaurants[J]. BMC Research Notes，2009（2）：108.

[3]Yang H，Ma X Y，Zhang X Z，et al. Development and evaluation of a loop-mediated isothermal amplification assay for the rapid detection of Staphylococcus aureus in food[J]. European Food Research and Technology，2011，232（5）：769-776.

[4]曾冰冰，肖凯军，石磊，等. LAMP方法在食品微生物检测中的应用[J]. 现代食品与药品杂志，2007，17（1）：22-25.

[5]Notomi T，Okayama H，Masubuchi H，et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA[J]. Nucleic Acids Research，2000，28（12）：e63.

[6]张琳，马利，丁雅苓，等. 基于荧光显色的IBV LAMP检测方法研究[J]. 西北农林科技大学学报：自然科学版，2012，40（10）：38-44.

[7]李永刚，王德国，武建刚，等. 环介导恒温扩增法（LAMP）检测金黄色葡萄球菌[J]. 食品工业科技，2010（1）：388-391.

[8]唐梦君，周生，葛庆联，等. 应用LAMP快速检测金黄色葡萄球菌的研究[J]. 现代食品科技，2011，27（6）：719-722.

[9]欧新华，张如胜，宋克云，等. 逆转录-环介导等温扩增方法检测甲型H1N1流感病毒[J]. 中华检验医学杂志，2010，33（5）：443-445.

[10]Rittié L，Perbal B. Enzymes used in molecular biology：a useful guide[J]. Journal of Cell Communications and Signaling，2008，2（1/2）：25-45.

[11]梁磊. 应用环介导等温扩增技术检测牛肉中大肠杆菌O157的研究[D]. 保定：河北农业大学，2011.

[12]Nagamine K，Hase T，Notomi T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers[J]. Molecular and Cellular Probes，2002，16（3）：223-229.endprint

2.1LAMP检测结果

本研究以金黄色葡萄球菌的nuc基因来设计特异性引物并进行LAMP 扩增检测，其扩增结果见图1，可以看出金黄色葡萄球菌的nuc基因用LAMP扩增后出现典型的梯状条带，而以蒸馏水代替DNA的阴性对照未出现梯状条带。另外发现，在扩增完成并且离心后，EP管底部出现白色沉淀，而阴性对照组未出现白色沉淀。

2.2LAMP检测条件优化结果

2.2.1LAMP反应温度应用建立的LAMP方法，在其他条件不变的情况下对反应温度进一步优化。如图2所示，泳道

5、7出现明显的梯状条带，而其余温度的没有扩增成功，说明该反应的最适反应温度为60 ℃。

2.2.2LAMP反应时间从图3可以看出：在其他条件不变的情况下，不同反应时间对扩增有影响，当反应时间为35 min时即开始扩增，且在45 min时出现了明显的梯状条带。

2.2.3LAMP引物图4表明：加入环引物与否并不影响LAMP 的成功扩增，但是加入环引物的LAMP扩增速率明显比未加环引物的扩增速率高（表1），加环引物的扩增只需 35 min，而未加环引物的需要45 min才可见到絮状沉淀，说明加环引物能加快LAMP的反应速率。

2.3LAMP检测特异性试验结果

应用上述试验建立并优化的LAMP反应条件，针对2株金黄色葡萄球菌、3株大肠杆菌、1株醋酸杆菌及1株沙门氏菌进行检测，结果显示：只有金黄色葡萄球菌显示阳性，而其余菌均显示阴性。说明本试验中根据金黄色葡萄球菌的nuc基因设计的引物具有较高的特异性。

2.4LAMP检测限试验结果

针对提取的DNA模板进行梯度稀释，即分别稀释为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的浓度。结果表明：阴性对照没有梯状条带出现，且LAMP检测的最低限度为 100 fg，较PCR有较高的检测限。

3结论

引物设计是LAMP法的关键，若引物质量不好，容易使引物间形成小于100 bp的聚合物[9]。本研究以金黄色葡萄球菌的nuc基因作为靶基因，并据该基因的6个位点设计引物，增加了扩增的特异性。针对所检测的菌种，仅有金黄色葡萄球菌显示阳性，而其余菌种均显示阴性，说明本研究设计的引物有较好的特异性。

BstDNA聚合酶大片段是分离于嗜热脂肪芽孢杆菌的DNA聚合酶的一部分，具有5′-3′核酸外切酶的活性[10]，不仅需要在高浓度的Mg2+环境下反应，而且温度不宜超过 70 ℃，以免使其失去活性。在本试验中，60 ℃时扩增效果最好，可能由于温度低于60 ℃时，酶的活性没有被激活，而温度到70 ℃时，酶的活性已经失去，因此未能扩增成功。

对于反应中加入环引物与未加环引物的研究，由本试验可知：加入环引物仅需30min即可看到白色絮状沉淀，而未加入环引物要45 min才可以看到沉淀。这与梁磊研究的加环引物的比未加环引物的提前1/3看到白色沉淀是一致的[11]，而且同Nagamine 等研究的加入环引物可以使反应时间缩短30%～50%的结果[12]一致。

LAMP是一种经济、快速、准确、灵敏的分子检测技术，已经被广泛应用于诸多领域，但是在国内较少应用于食品质量检测方面，可能由于筛选合适的引物比较困难。随着研究的不断深入，相信LAMP技术会很快普及到食品安全检测领域。

参考文献：

[1]高涛. 食品中金黄色葡萄球菌肠毒素及检测方法的研究进展[J]. 福建分析测试，2003，12（2）：39-42.

[2]Udo E E，Al-Mufti S，Albert M J. The prevalence of antimicrobial resistance and carriage of virulence genes in Staphylococcus aureus isolated from food handlers in Kuwait City restaurants[J]. BMC Research Notes，2009（2）：108.

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[6]张琳，马利，丁雅苓，等. 基于荧光显色的IBV LAMP检测方法研究[J]. 西北农林科技大学学报：自然科学版，2012，40（10）：38-44.

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[8]唐梦君，周生，葛庆联，等. 应用LAMP快速检测金黄色葡萄球菌的研究[J]. 现代食品科技，2011，27（6）：719-722.

[9]欧新华，张如胜，宋克云，等. 逆转录-环介导等温扩增方法检测甲型H1N1流感病毒[J]. 中华检验医学杂志，2010，33（5）：443-445.

[10]Rittié L，Perbal B. Enzymes used in molecular biology：a useful guide[J]. Journal of Cell Communications and Signaling，2008，2（1/2）：25-45.

[11]梁磊. 应用环介导等温扩增技术检测牛肉中大肠杆菌O157的研究[D]. 保定：河北农业大学，2011.

[12]Nagamine K，Hase T，Notomi T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers[J]. Molecular and Cellular Probes，2002，16（3）：223-229.endprint

2.1LAMP检测结果

本研究以金黄色葡萄球菌的nuc基因来设计特异性引物并进行LAMP 扩增检测，其扩增结果见图1，可以看出金黄色葡萄球菌的nuc基因用LAMP扩增后出现典型的梯状条带，而以蒸馏水代替DNA的阴性对照未出现梯状条带。另外发现，在扩增完成并且离心后，EP管底部出现白色沉淀，而阴性对照组未出现白色沉淀。

2.2LAMP检测条件优化结果

2.2.1LAMP反应温度应用建立的LAMP方法，在其他条件不变的情况下对反应温度进一步优化。如图2所示，泳道

5、7出现明显的梯状条带，而其余温度的没有扩增成功，说明该反应的最适反应温度为60 ℃。

2.2.2LAMP反应时间从图3可以看出：在其他条件不变的情况下，不同反应时间对扩增有影响，当反应时间为35 min时即开始扩增，且在45 min时出现了明显的梯状条带。

2.2.3LAMP引物图4表明：加入环引物与否并不影响LAMP 的成功扩增，但是加入环引物的LAMP扩增速率明显比未加环引物的扩增速率高（表1），加环引物的扩增只需 35 min，而未加环引物的需要45 min才可见到絮状沉淀，说明加环引物能加快LAMP的反应速率。

2.3LAMP检测特异性试验结果

应用上述试验建立并优化的LAMP反应条件，针对2株金黄色葡萄球菌、3株大肠杆菌、1株醋酸杆菌及1株沙门氏菌进行检测，结果显示：只有金黄色葡萄球菌显示阳性，而其余菌均显示阴性。说明本试验中根据金黄色葡萄球菌的nuc基因设计的引物具有较高的特异性。

2.4LAMP检测限试验结果

针对提取的DNA模板进行梯度稀释，即分别稀释为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的浓度。结果表明：阴性对照没有梯状条带出现，且LAMP检测的最低限度为 100 fg，较PCR有较高的检测限。

3结论

引物设计是LAMP法的关键，若引物质量不好，容易使引物间形成小于100 bp的聚合物[9]。本研究以金黄色葡萄球菌的nuc基因作为靶基因，并据该基因的6个位点设计引物，增加了扩增的特异性。针对所检测的菌种，仅有金黄色葡萄球菌显示阳性，而其余菌种均显示阴性，说明本研究设计的引物有较好的特异性。

BstDNA聚合酶大片段是分离于嗜热脂肪芽孢杆菌的DNA聚合酶的一部分，具有5′-3′核酸外切酶的活性[10]，不仅需要在高浓度的Mg2+环境下反应，而且温度不宜超过 70 ℃，以免使其失去活性。在本试验中，60 ℃时扩增效果最好，可能由于温度低于60 ℃时，酶的活性没有被激活，而温度到70 ℃时，酶的活性已经失去，因此未能扩增成功。

对于反应中加入环引物与未加环引物的研究，由本试验可知：加入环引物仅需30min即可看到白色絮状沉淀，而未加入环引物要45 min才可以看到沉淀。这与梁磊研究的加环引物的比未加环引物的提前1/3看到白色沉淀是一致的[11]，而且同Nagamine 等研究的加入环引物可以使反应时间缩短30%～50%的结果[12]一致。

LAMP是一种经济、快速、准确、灵敏的分子检测技术，已经被广泛应用于诸多领域，但是在国内较少应用于食品质量检测方面，可能由于筛选合适的引物比较困难。随着研究的不断深入，相信LAMP技术会很快普及到食品安全检测领域。

参考文献：

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[6]张琳，马利，丁雅苓，等. 基于荧光显色的IBV LAMP检测方法研究[J]. 西北农林科技大学学报：自然科学版，2012，40（10）：38-44.

[7]李永刚，王德国，武建刚，等. 环介导恒温扩增法（LAMP）检测金黄色葡萄球菌[J]. 食品工业科技，2010（1）：388-391.

[8]唐梦君，周生，葛庆联，等. 应用LAMP快速检测金黄色葡萄球菌的研究[J]. 现代食品科技，2011，27（6）：719-722.

[9]欧新华，张如胜，宋克云，等. 逆转录-环介导等温扩增方法检测甲型H1N1流感病毒[J]. 中华检验医学杂志，2010，33（5）：443-445.

[10]Rittié L，Perbal B. Enzymes used in molecular biology：a useful guide[J]. Journal of Cell Communications and Signaling，2008，2（1/2）：25-45.

[11]梁磊. 应用环介导等温扩增技术检测牛肉中大肠杆菌O157的研究[D]. 保定：河北农业大学，2011.

[12]Nagamine K，Hase T，Notomi T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers[J]. Molecular and Cellular Probes，2002，16（3）：223-229.endprint