人工诱导对鱼类性别分化和性别决定的影响综述

单红　周国勤　陈树桥　茆健强

摘要：鱼类性别控制对于水产养殖具有十分重要的指导意义。目前用于生产实践的鱼类人工性别控制方法有很多，包括温度、外源激素和芳香化酶抑制剂等，但大多数仍然处于探索与试验阶段。本文通过对鱼类性别决定机制、相关基因及人工诱导鱼类性别分化的方法等方面国内外研究进展的阐述，为鱼类性别控制、调控养殖鱼类的经济性状等提供有益的参考。

关键词：鱼类；性别决定；性别分化；人工诱导

中图分类号：S917文献标志码：A文章编号：1002-1302（2014）01-0197-03

收稿日期：2013-05-20

基金项目：江苏省水产三项工程项目（编号：PJ2011-1）。

作者简介：单红（1980—），女，江苏南京人，博士，高级工程师，主要从事水生动物遗传育种研究。E-mail：jiangxue0011@sina.com。鱼类性别决定的基因型在受精时就己经形成，但作为一种低等脊椎动物，千差万别的生活环境决定了其性别决定方式的多样化。大量研究结果表明，雌雄异体鱼类的性别决定除受遗传因素的控制外，也容易受到环境因素诸如温度、光照、水质和外源激素等的影响。因此，多年来在鱼类养殖生产实践中，对于一些雌、雄鱼经济性状差异较大的养殖鱼类，人们一直探索着如何通过人工诱导的方式提高养殖群体中雌鱼或雄鱼的比例，以提高养殖产量和获得经济价值高（如生长率和个体大小等）的商品鱼。因此，研究鱼类的性别决定以及各种人为因素对性别分化的影响，在鱼类发育生物学理论上和养殖生产实践上都具有重要的意义。

1鱼类性别决定及相关基因

鱼类性别决定机制非常复杂，几乎具有所有脊椎动物的性别决定方式，存在从雌雄同体到雌雄异体的各种性别类型，性逆转是鱼类中较为常见的现象。与其他高等脊椎动物不同，在许多鱼类中决定性别的基因不明显地集中于性染色体，常染色体上的基因也参与到性别决定中，这些基因共同决定和控制鱼类的初始性别。近年来，随着分子生物学技术的发展，鱼类性别决定相关基因的研究取得了一些重要进展。其中，研究较多的有DMY基因、芳香化酶基因、Sox基因家族和Dmrt基因家族等，这为从分子水平上阐明鱼类的性别决定和分化机制奠定了基础。

1.1DMY基因

DMY（DM domain gene on Y-chromosome）基因是在青鳉（Oryzias latipes）体内发现的1个性别决定基因，也是首次在非哺乳类脊椎动物中发现的性别决定候选基因。Matsuda等用重组断点法将青鳉的性别决定区定位于Y染色体 530 kb 的区段上，随后发现了1个性反转XY雌性个体，进一步分析将性别决定区缩小到250 kb区段，鸟枪法测序得到了27个基因，其中1个是Y染色体特异的，含有DM结构域，故命名为DMY[1]。Shinomiya等通过大量调查发现在野生青鳉种群中大约存在1%的性别反转个体，并且检测出他们都携带有突变的DMY基因，进一步证实了DMY基因是青鳉的性别决定基因[2]。但随后的研究发现，一些与青鳉亲缘关系较近的物种及其他硬骨鱼类中均未发现DMY基因的同源基因，表明它不是鱼类中广泛存在的性别决定基因。

1.2芳香化酶基因

芳香化酶（aromatase）是催化雄激素向雌激素转化的一个关键酶，它能够催化睾酮和雄烯二酮等雄激素转化为雌激素[3]。在芳香化反应过程中，细胞色素P450芳香化酶起主导作用，对调节整个性类固醇激素的平衡有重要意义。Sudhakumari等详细研究了尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）P450芳香化酶基因的表达与作用，结果显示P450芳香化酶基因在雌雄鱼体中具有明显的表达差异，在卵巢中的表达显著强于在精巢中的表达[4]；在对奥利亚罗非鱼（Oreochromis aureus）的研究中发现，P450芳香化酶仅在卵巢中表达，精巢中无表达[5]；青鳉[6]和欧洲海鲈（Dicentrarchus labrax）[7]的P450芳香化酶亦在卵巢中表达，精巢中几乎不表达。此外，鱼类体内芳香化酶的表达水平和活性还与雌激素生成量以及生殖细胞发育有关。莫桑比克罗非鱼（Tilapia mossambica）卵巢合成17β-雌二醇的能力与芳香化酶mRNA水平及蛋白含量密切相关；虹鳟鱼（Oncorhynchus mykiss）体内促性腺激素的含量随芳香化酶活性的提高而增加；日本鳗鲡（Anguilla japonica）血液中17β-雌二醇的含量与芳香化酶的活性有关，滤泡细胞层分泌17β-雌二醇的量取决于芳香化酶活性的高低。

1.3Sox基因家族

Sox（sry-related box）基因家族含有1个SRY样HMG盒，广泛参与包括性别决定与性腺分化在内的多个性腺发育事件。其中受到较多重视的是Sox9基因，其HMG结构域可与DNA序列特异性结合，而该区域的突变将会使其失去结合能力从而导致性反转。Northern杂交分析结果表明，Sox9在大鳞副泥鳅（Paramisgurnus dabryanus）精巢中高表达，表明该基因与精巢形成和分化有关。Yokoi等从青鳉中分离出Sox9基因，原位杂交分析发现其主要在成鱼的卵巢中表达，在精巢中表达较少，表明其在性腺分化过程中具有不同的作用方式[8]。Galay-Burgos等[9]和Hett等[10]分别从欧洲海鲈和欧洲大西洋鲟（Acipenser sturio）中获得12个和8个Sox基因，其中部分存在基因重复现象，这些在鱼类中克隆到的与哺乳动物性别决定基因的同源基因没有保守的性别决定功能，或者其功能有待于进一步验证。

1.4DMRT基因家族

DMRT（doublesex and mab-3 related transcription factor）基因家族是1类转录调控因子，含有果蝇的doublesex基因和线虫mab-3基因共有的DM-domain蛋白序列，其编码的产物以锌指方式与特异的DNA序列相结合，调控基因表达[11]。其中Dmrt1是一个与性别决定和性腺分化的相关转录因子编码基因，被认为是脊椎动物中最原始的性别相关基因，为继Sox9之后发现的又1个性别相关的重要基因。Guo等发现DMRT1基因在斑马鱼（Danio rerio）精巢和卵巢发育中都有表达，证明DMRT基因不仅与其精巢发育密切相关，而且在卵巢发育过程中也起到重要作用[12]。此外，鱼类中DMRT基因家族的功能变化很多，其很多成员都有明显的组织特异性，与性别分化有着一定的联系。

2人工诱导鱼类性别分化

2.1温度诱导鱼类性别分化

环境因素对性别决定和分化影响的现象已在包括野生型种群和实验种群在内的39种硬骨鱼中发现，最主要的因素是温度，其次是种群密度、盐度、pH值、光周期等。鱼类的温度依赖型性别决定（temperature-dependental sex-determination，TSD）大致可以划分为3种类型。第1种类型是高温下生成较多的雄性低温则生成较多的雌性，大多数鱼类均属于此种类型。Dcotta等利用高温处理性别分化期的尼罗罗非鱼，发现升温可使尼罗罗非鱼的芳香化酶mRNA表达水平降低，雌二醇分泌量减少，最终使基因型为雌性的个体雄性化[13]。Desprez等研究报道，奥利亚罗非鱼的雌雄比率随着温度的变化而变化，在34 ℃时后代雄性比例高达97.8 %；在27 ℃时雌、雄比例趋于平衡，雄性为63%[14]。Uchida等研究发现分别在28.5、35、37 ℃水温条件下饲养雌性基因型斑马鱼至40 d，性腺出现雄性化的比率不断上升，分别为0、688%和100%[15]。第2种类型则与之相反，高温下为雌性，低温为雄性。Blaquez等在海鲈鱼中发现其发育处于15 ℃时雄性占绝对优势，在24～25 ℃时，雄性比例下降至27%以下；性染色体为XY的鲶鱼（Ictalurus unctuatus），在其性别决定的关键时期，高温使群体趋向雌性；大马哈鱼（Oncorhynchus nerka）在温度升高时群体发育也趋向雌性[16]。第3种类型是高低温均诱导出单性雄性种群，中间温度发育为性比1 ∶1的种群。如泥鳅（Misgurnus anguillicautus）[17]和大鳞副泥鳅[18]在高温（25～30 ℃）处理下均能得到明显的偏雄性群体，雄性比率达80%以上，而在20 ℃条件下发育形成性比接近1 ∶1的种群；牙鲆（paralichthys olivaceus）[19]在升温及降温时，其雌性个体比例减少，中间温度时种群比为1 ∶1。

2.2外源激素诱导鱼类性别分化

自1969年日本学者Yamamoto提出用外源性激素诱导鱼类雄性化和雌性化的设想后，几十年来国内外相继有许多学者在各种不同的鱼类进行了外源类固醇激素诱发性逆转的试验。通过对鱼体进行性激素的处理，使鱼群体由基因型的雄性或雌性转变成为具有功能性的表现型雌性或雄性，常用方法有注射、口服、浸泡和将激素药丸植入鱼体内等。

具有雄性化效应的外源激素如17α-甲基睾酮（17α-MT）、17β-去甲雄三烯醇酮（TB）、醋酸去甲雄三烯醇酮（TBA）、11-酮基睾酮（11-KT）、11β-羟雄烯二酮（OHA）等，它们能够影响鱼类性腺发育过程，改变鱼体个体内源激素表达水平，从而引起鱼类群体性别比率的改变。将性成熟的雄性斑马鱼暴露于不同浓度的17α-MT中，发现当浓度达到6.4 ng/L和8.5 ng/L时即可明显抑制内源酮基睾酮（KT）和睾酮（T）的表达，62.3 ng/L的17α-MT使KT和T的表达水平分别降低了96.6%和79.8%[20]。Sone等研究发现，雌性食蚊鱼（Gambusia affinis）幼鱼暴露于1 μg/L和10 μg/L TB中，28 d后雌鱼体内出现卵精巢结构，卵巢中出现精子[21]。Arslan等采用1 mg/L TBA处理黑斑刺盖太阳鱼（Pomoxis nigromaculatus）幼鱼，发现暴露组雄鱼比例为100%，完全偏离了对照的1 ∶1比例；同样，17β-雌二醇（E2），17α-乙炔基雄二醇（EE2），二乙基己烯雌酚（DES）等雌激素对鱼类具有雌性化效应，能够诱发鱼类性腺向雌性化方向发育，导致雄鱼发育成为功能性雌鱼[22]。Wang等采用含有不同浓度E2的饲料分别喂养30 d龄大鰭鳞鳃太阳鱼（Lepomis macrochirus）60 d后，发现大部分雄鱼性腺发育为卵巢样结构，其中 150 mg/kg 实验组鱼体雌性化效应最为明显[23]。Labadie等[24]研究结果表明低浓度EE2能够抑制大菱鲆（Psetta maxima）体内雄烯二酮和11-KT的合成，降低其在血浆中的含量，精巢中出现雌激素的表达。用10 μg/L DES处理雄性银鲤（Carassius auratus）14 d后，发现鱼体内精母细胞解体，精巢结构明显退化并向卵巢方向发育[25]。

2.3芳香化酶抑制剂（aromatase inhabit，AI）诱导鱼类性别分化

芳香化酶是将睾酮转化成17β-雌二醇的一个关键酶，若将其抑制必然会导致17β-雌二醇不能合成，从而使尚未分化的幼鱼由于缺乏雌激素而趋向雄性化。因此，在鱼苗性未分化阶段用芳香化酶抑制剂（AI）抑制芳香化酶的作用，可以在一定程度上诱导雄性化个体的产生。Piferrer等在用AI处理斑马鱼时，在饲料中添加AI浓度为10 μg/g，雄鱼比例达625%；加大AI的浓度到100 μg/g或500 μg/g时，雄鱼率均达到100%；如果使用AI时伴用低剂量的MT会达到更好的雄性化效果[26]；但Bhandari等发现，外源雌激素会完全阻碍AI的作用，抑制其趋向雄性化的可能[27]。

参考文献：

[1]Matsuda M，Nagahama Y，Shinomiya A，et al. DMY is a Y-specific DM-domain gene required for male development in the medaka fish[J]. Nature，2002，417（6888）：559-563.

[2]Shinomiya A，Otake H，Togashi K，et al. Field survey of sex-reversals in the medaka，Oryzias latipes：genotypic sexing of wild populations[J]. Zoological Science，2004，21（6）：613-619.

[3]Conley A J，Corbin C J，Hughes A L. Adaptive evolution of mammalian aromatases：lessons from Suiformes[J]. Journal of Experimental Zoology Part A-Ecological Genetics and Physiology，2009，311（5）：346-357.

[4]Sudhakumari C C，Senthilkumaran B，Kobayashi T，et al. Ontogenic expression patterns of several nuclear receptors and cytochrome P450 aromatases in brain and gonads of the Nile tilapia Oreochromis niloticus suggests their involvement in sex differentiation[J]. Fish Physiology and Biochemistry，2005，31（2/3）：129-135.

[5]唐永凯，李建林，陈文华，等. 奥利亚罗非鱼卵巢芳香化酶基因的克隆及其表达[J]. 中国水产科学，2008，15（5）：729-737.

[6]Zhou L Y，Wang D S，Shibata Y，et al. Characterization，expression and transcriptional regulation of P450c17-I and-II in the medaka，Oryzias latipes[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications，2007，362（3）：619-625.

[7]Blazquez M，Gonzalez A，Papadaki M，et al. Sex-related changes in estrogen receptors and aromatase gene expression and enzymatic activity during early development and sex differentiation in the European sea bass（Dicentrarchus labrax）[J]. General and Comparative Endocrinology，2008，158（1）：95-101.

[8]Yokoi H，Kobayashi T，Tanaka M，et al. Sox9 in a teleost fish，medaka（Oryzias latipes）：evidence for diversified function of Sox9 in gonad differentiation[J]. Molecular Reproduction and Development，2002，63（1）：5-16.

[9]Galay-Burgos M，Llewellyn L，Mylonas C C，et al. Analysis of the Sox gene family in the European sea bass（Dicentrarchus labrax）[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part B：Biochemistry & Molecular Biology，2004，137（2）：279-284.

[10]Hett A K，Pitra C，Jenneckens I，et al. Characterization of Sox9 in European Atlantic sturgeon（Acipenser sturio）[J]. Journal of Heredity，2005，96（2）：150-154.

[11]唐永凯，王光花，吴婷婷.奥利亚罗非鱼DMRT1，DMO基因片段的克隆及序列分析[J]. 生物技术，2006，16（2）：1-3.

[12]Guo Y，Cheng H，Huang X，et al. Gene structure，multiple alternative splicing，and expression in gonads of zebrafish Dmrt1[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications，2005，330（3）：950-957.

[13]DCotta H，Fostier A，Guiguen Y，et al. Aromatase plays a key role during normal and temperature-induced sex differentiation of tilapia Oreochromis niloticus[J]. Molecular Reproduction and Development，2001，59（3）：265-276.

[14]Desprez D，Melard C. Effect of ambient water temperature on sex determination in the blue tilapia Oreochromis aureus[J]. Aquaculture，1998，162（1/2）：79-84.

[15]Uchida D，Yamashita M，Kitano T，et al. An aromatase inhibitor or high water temperature induce oocyte apoptosis and depletion of p450 aromatase activity in the gonads of genetic female zebrafish during sex-reversal[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part A：Molecular & Integrative Physiology，2004，137（1）：11-20.

[16]Blaquez M，Zanuy S，Carillo M，et al. Effects of rearing temperature on sex differentiation in the European sea bass（Dicentrarchus labrax L.）[J]. Journal of Experimental Zoology，1998，281（3）：207-216.

[17]Tomoko N，Katsutoshi A，Taiga H，et al. Effect of temperature on sex ratios of normal and gynogenetic diploid loach[J]. Fisheries Science，1998，64（5）：753-758.

[18]南平，杜启艳，燕帅国，等. 温度对泥鳅和大鳞副泥鳅性腺分化的影响和CYP19a基因的克隆与时空表达[J]. 中国水产科学，2005，12（4）：407-413.

[19]Yamamoto E. Studies on sex-manipulation and production of cloned populations in hirame，Paralichthys olivaceus（Temminck et Schlegel）[J]. Aquaculture，1999，173（1/2/3/4）：235-246.

[20]Andersen L，Goto-Kazeto R，Trant J M，et al. Short-term exposure to low concentrations of the synthetic androgen methyltestosterone affects vitellogenin and steroid levels in adult male zebrafish（Danio rerio）[J]. Aquatic Toxicology，2006，76（3/4）：343-352.

[21]Sone K，Hinago M，Itamoto M，et al. Effects of an androgenic growth promoter 17β-trenbolone on masculinization of mosquitofish（Gambusia affinis）[J]. General and Comparative Endocrinology，2005，143（2）：151-160.

[22]Arslan T，Phelps R P. Production of monosex male black crappie，Pomoxis nigromaculatus，populations by multiple androgen immersion[J]. Aquaculture，2004，234（1/2/3/4）：561-573.

[23]Wang H P，Gao Z，Beres B，et al. Effects of estradiol-17β on survival，growth performance，sex reversal and gonadal structure of bluegill sunfish Lepomis macrochirus[J]. Aquaculture，2008，285（1/2/3/4）：216-223.

[24]Labadie P，Budzinski H. Alteration of steroid hormone profile in juvenile turbot（Psetta maxima）as a consequence of short-term exposure to 17α-ethynylestradiol[J]. Chemosphere，2006，64（8）：1274-1286.

[25]Yang L，Lin L，Weng S，et al. Sexually disrupting effects of nonylphenol and diethylstilbestrol on male silver carp（Carassius auratus）in aquatic microcosms[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety，2008，71（2）：400-411.

[26]Piferrer F，Zanuy S，Carrillo M，et al. Brief treatment with an aromatase inhibitor during sex differentiation causes chromosomally female salmon to develop as normal，functional males[J]. Journal of Experimental Zoology，1994，270（3）：255-262.

[27]Bhandari R K，Alam M A，Higa M，et al. Evidence that estrogen regulates the sex change of honeycomb grouper（Epinephelus merra），a protogynous hermaphrodite fish[J]. Journal of Experimental Zoology Part A：Comparative Experimental Biology，2005，303（6）：497-503.李家富，张涛，陆勤勤，等. 不同温度条件下条斑紫菜叶绿素的荧光特征[J]. 江苏农业科学，2014，42（1）：200-203.