葵花籽仁中绿原酸的提取工艺

李延辉，塔长青，刘超，郑凤荣

（吉林农业科技学院食品工程学院，吉林吉林132101）

葵花籽仁中绿原酸的提取工艺

李延辉，塔长青，刘超，郑凤荣

（吉林农业科技学院食品工程学院，吉林吉林132101）

研究从葵花籽仁中提取绿原酸的最佳工艺条件。比较乙醇浸提法、微波提取法、超声波法的提取率，确定提取绿原酸的最佳方法为超声波法。研究乙醇浓度（A）、提取温度（B）、提取时间（C）、超声波功率（D）、料液比（E）对葵花籽绿原酸得率的影响，通过单因素及正交试验，结果显示，各因素对提取效果影响的顺序主次为乙醇浓度＞超声波功率＞提取温度＞提取时间。最佳提取工艺条件为：乙醇浓度75%，提取温度40℃，提取时间30min，超声波功率300W。此工艺条件下绿原酸提取率为2.43%。

葵花籽仁；绿原酸；提取工艺；超声波

我国葵花籽在农业生产中占有较重的分量，年总产量位于世界第六[1]。葵花籽作为向日葵的果实，其多酚类物质成分中主要是绿原酸，实质是一种缩酚酸[2]。绿原酸在医药方面被广泛研究与应用具有抗菌、抗病毒、降脂、清除自由基等作用[3]。在食品方面绿原酸还可以被用作食品的添加剂等，如果将绿原酸应用于果蔬保鲜中[4]。绿原酸极易被氧化近而形成邻醌，不仅影响到蛋白产品的感官质量，而且大大降低了蛋白质的营养价值和功效[5]。因此，将葵花籽粕中的绿原酸提取出来，不仅能避免由于绿原酸的存在引起的葵花籽分离蛋白变黑引起的色泽不稳定现象，同时还能创造更高的经济效益，为葵花籽蛋白的进一步利用创造了必要的条件，提升葵花籽及葵花籽粕的商业价值[6]。

目前提取绿原酸的方法很多，如水提醇沉法、微波提取、乙醇提取、酶法提取、超声波提取等[7]。本文通过单因素及正交试验，得到最佳的提取工艺，为葵花籽粕中提取绿原酸的工业化提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料试剂与仪器

葵花籽仁：市场购买（碾碎，除油干燥，备用）。

绿原酸标准样品（中国药品生物制品检定所，纯度98.2%）。乙醇（分析纯）、甲醇（分析纯）、正己烷（化学纯）、乙酸乙酯（分析纯）等。

DHG-9420A型电热恒温古风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司；G8ON25YSL-501A型微波炉：佛山市顺德区格兰仕微波炉电器有限公司；SY-360型超声波清洗器：上海精宏实验设备有限公司；UV-1700光栅紫外可见分光光度计“上海精宏科学仪器有限公司；LG-08A型两装高速中药粉碎机：瑞安市百信药机械厂；AL104型分析天平：梅特勒-托利多仪器上海有限公司；HH-4型数显恒温水浴锅：国华电器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 提取剂的选择

绿原酸属于一种弱酸性化合物，易溶于水、乙醇、甲醇等极性溶剂的极性有机酸，不溶于苯、乙醚、氯仿等非极性溶剂[8]。本实验选用乙醇作为提取剂。

1.2.2 工艺流程

乙醇浸提法：原料挑选→去壳→粉碎→除油→干燥→乙醇溶剂浸提两次→合并浸提液→过滤→萃取纯化→测吸光度值→计算绿原酸得率。

超声波辅助提取法：原料挑选→去壳→粉碎→除油→干燥→超声波辅助提取→过滤→萃取纯化→测吸光度值→计算绿原酸得率。

微波辅助提取法：原料挑选→去壳→粉碎→除油→干燥→微波辅助提取→过滤→萃取纯化→测吸光度值→计算绿原酸得率。

1.2.3 操作要点

1.2.3.1 原料的选择及处理

选择质粒饱满新鲜的葵花籽，机械去壳，用粉碎机充分粉碎，称取粉碎的葵花籽粕300 g移入干净大烧杯中，按1∶2（g/mL）的料液比加入正己烷溶液，浸泡2 h，将烧杯置于超声波清洗器中，设定功率为400W，75℃下处理15min，过滤后倾出上清液，将沉淀物放入80℃恒温鼓风干燥箱中烘干至恒重，过40目筛[9]，备用。

1.2.3.2 乙醇溶剂浸提法

准确称取脱脂并烘干的葵花籽粕5.00 g，置于250mL锥形瓶中，调pH为4.5，在70℃恒温水浴锅中用75%的乙醇溶剂浸提两次[10]，料液比为1∶15（g/mL）和1∶10（g/mL），每次浸提时间为40min，合并浸提液，滤液用旋转蒸发仪浓缩至30mL，用乙酸乙酯进行萃取，乙酸乙酯与原料液的体积比为1.5∶1，再浓缩，浓缩液用相应浓度的乙醇定容至50mL容量瓶中，稀释10倍，在324 nm[11]处测吸光度，计算得率。

1.2.3.3 微波辅助提取法

准确称取脱脂并烘干的葵花籽粕5.00 g，置于250mL锥形瓶中，加入75%的乙醇溶剂100mL，置于微波炉内，60℃在440W下提取7min[12]。滤液用旋转蒸发仪浓缩至30mL，用乙酸乙酯进行萃取，乙酸乙酯与原料液的体积比为1.5∶1，再浓缩，浓缩液用相应浓度的乙醇定容至50mL容量瓶中，稀释10倍，在324 nm处测吸光度，计算得率。

1.2.3.4 超声波辅助提取法

准确称取脱脂并烘干的葵花籽粕5.00 g，置于250mL锥形瓶中，加入75%的乙醇溶剂100mL，置于超声波清洗器内，超声波功率为300W，30℃超声提取30min。滤液用旋转蒸发仪浓缩至30mL，用乙酸乙酯进行萃取，乙酸乙酯与原料液的体积比为1.5∶1，再浓缩，浓缩液用相应浓度的乙醇定容至50mL容量瓶中，稀释10倍，324 nm处测吸光度，计算得率。

1.2.4 绿原酸最大吸收波长的确定

将绿原酸标准溶液用UV-1700紫外分光光度计在220 nm～440 nm范围内扫描，测定其吸光度，确定绿原酸最大吸收波长。

1.2.5 绿原酸标准工作曲线的绘制[2]

以50%甲醇为空白对照，准确称取绿原酸标准品10.0mg，用50%甲醇溶解并定容至50mL容量瓶，摇匀得0.2mg/mL的标准溶液。分别准确吸取1、2、3、4、5、6、7、8mL标准溶液于8个10mL容量瓶中，加50%甲醇定容至刻度，摇匀得到不同质量浓度标准溶液。用紫外分光光度计在220 nm~440 nm波长范围内进行扫描，选取绿原酸的最大吸收波长，在该波长处分别测定各浓度标准溶液的吸光度（A）。以绿原酸标准液的浓度（C）为横坐标，其吸光度为纵坐标绘制标准曲线，确定绿原酸浓度-吸光度关系曲线回归方程。

1.2.6 绿原酸得率计算[12]

式中：C为标准曲线绿原酸的浓度，（mg/mL）；N为稀释倍数（10）；V为溶液体积（50mL）；W为葵花籽粕质量，g。

1.2.7 3种提取方法结果的比较

3种提取方法结果的比较见表1。

表1 3种方法的绿原酸提取率Table1 Comparing of threeextractions

通过前期试验比较，超声波提取绿原酸的效果较好，在同质量下提取率为2.16%，而且通过超声作用可以减少实验时间，故针对此方法进行工艺优化。

1.2.7 超声波法提取绿原酸的工艺优化

1.2.7.1 单因素试验

分别选取乙醇浓度55%、65%、75%、85%、95%；提取温度25、30、35、40、45℃；提取时间20、25、30、35、40min；超声波功率为100、200、300、400、500W；料液比1∶12、1∶16、1∶20、1∶24、1∶28（g/mL）5个水平进行单因素试验，选出最佳因素和水平。

1.2.7.2 乙醇浓度对葵花籽绿原酸得率的影响

准确称取脱脂并烘干的葵花籽粉末2.5 g，按照1∶20（g/mL）的料液比加入不同体积分数的乙醇溶液置于150mL锥形瓶中，超声波功率为300W，35℃提取30 min，分离出提取液，过滤，滤液用旋转蒸发仪浓缩至30mL，用乙酸乙酯进行萃取，乙酸乙酯与原料液的体积比为1.5∶1，再浓缩，浓缩液定容至50mL容量瓶中，稀释，在324 nm处测吸光度，计算得率，确定乙醇的最佳提取浓度。

1.2.7.3 提取温度对葵花籽绿原酸得率的影响

准确称取脱脂并烘干的葵花籽粉末2.5 g，按照1∶20（g/mL）的料液比加入75%的乙醇溶液置于150mL锥形瓶中，超声波功率为300W，不同温度下超声波提取30min，分离出提取液，过滤，滤液用旋转蒸发仪浓缩至30mL，用乙酸乙酯进行萃取，乙酸乙酯与原料液的体积比为1.5∶1，再浓缩，浓缩液定容至50mL容量瓶中，稀释，在324 nm处测吸光度，计算得率，确定最佳提取温度。

1.2.7.4 提取时间对葵花籽绿原酸得率的影响

准确称取脱脂并烘干的葵花籽粉末2.5 g，按照1∶20（g/mL）的料液比加入75%的乙醇溶液置于150mL锥形瓶中，超声波功率为300W，35℃超声波提取不同时间，分离出提取液，过滤，滤液用旋转蒸发仪浓缩至30mL，用乙酸乙酯进行萃取，乙酸乙酯与原料液的体积比为1.5∶1，再浓缩，浓缩液定容至50mL容量瓶中，稀释，在324 nm处测吸光度，计算得率，确定最佳提取时间。

1.2.7.5 超声波功率对葵花籽绿原酸得率的影响

准确称取脱脂并烘干的葵花籽粉末2.5 g，按照1∶20（g/mL）的料液比加入75%的乙醇溶液置于150mL锥形瓶中，在不同的超声波功率下，35℃超声波提取30min，分离出提取液，过滤，滤液用旋转蒸发仪浓缩至30mL，用乙酸乙酯进行萃取，乙酸乙酯与原料液的体积比为1.5∶1，再浓缩，浓缩液定容至50mL容量瓶中，稀释，在324 nm处测吸光度，计算得率，确定最佳的超声波功率。

1.2.7.6 料液比对葵花籽绿原酸得率的影响

准确称取脱脂并烘干的葵花籽粉末2.5 g，分别以1∶12、1∶16、1∶20、1∶24、1∶28（g/mL）的料液比加入75%的乙醇溶液置于150mL锥形瓶中，在300W，35℃超声波提取30min，提取液用微孔膜过滤后用旋转蒸发仪浓缩至30mL，用乙酸乙酯进行萃取，乙酸乙酯与原料液的体积比为1.5∶1，再浓缩，浓缩液定容至50mL容量瓶中，稀释，在324 nm处测吸光度，计算得率，确定最佳的料液比。

1.2.7.7 提取条件的优化处理

在单因素试验基础上，以绿原酸得率为指标，选取乙醇浓度、提取温度、提取时间、超声波功率为考察因素，各取3个水平，设计正交试验，每项试验重复3次，对超声波辅助提取葵花籽绿原酸工艺进行优化。

2 结果与分析

2.1 绿原酸最大吸收波长的确定

将绿原酸标准溶液用UV-1700紫外分光光度计在220 nm～440 nm范围内扫描，测定其吸光度，确定绿原酸最大吸收波长，结果如图1所示。

图1 绿原酸标准液的吸收光谱图Fig.1 Absorption spectrum of Chlorogenic acid standard solution

从图1可以看出，绿原酸标准溶液的吸收光谱在324 nm处出现最高峰，且吸光度达到最大值为0.662，所以选择波长324 nm为绿原酸的检测波长。

2.2 绿原酸标准工作曲线的绘制

以50%甲醇为空白对照，准确称取绿原酸标准品10.0mg，用50%甲醇溶解并定容至50mL容量瓶，摇匀得0.2mg/mL的绿原酸标准溶液。分别准确吸取1、2、3、4、5、6、7、8mL标准溶液于8个10mL容量瓶中，加50%甲醇定容至刻度，得到不同质量浓度的绿原酸标准溶液。用紫外分光光度计在220nm~440 nm波长范围内进行扫描，选取绿原酸的最大吸收波长为324 nm，在324 nm波长处分别测定各浓度标准溶液的吸光度（A）。以绿原酸标准液的浓度（C）为横坐标，其吸光度为纵坐标绘制标准曲线见图2。

图2 绿原酸标准曲线Fig.2 Standard curveof Chlorogenic acid

从图2可以确定绿原酸浓度-吸光度关系曲线回归方程：A=3.573 7C+0.176 0，R2=0.999 8。结果表明，绿原酸在0.02mg/mL~0.160mg/mL浓度范围内，绿原酸浓度与吸光度呈良好的线性关系。

2.3 单因素实验结果与分析

2.3.1 乙醇浓度对葵花籽绿原酸得率的影响

不同浓度的乙醇溶液对绿原酸提取率结果如图3所示。

图3 乙醇浓度对绿原酸提取率的影响Fig.3 Chlorogenic acid yield effectof ethanolconcentration

从图3可以看出，在55%至75%范围内，随着乙醇浓度的增加，乙醇溶解绿原酸的能力也增强，乙醇浓度达到75%时提取率最高，随后提取率又呈下降趋势。原因经分析有两点，一是由于长时间的超声波热效应作用，乙醇浓度越高越容易挥发，使得高浓度的乙醇挥发较快而提取率下降；二是由于高浓度的乙醇容易使葵粕中蛋白质变质，进而包埋住绿原酸使其提取率下降。因此，综合以上因素考虑，选择75%乙醇溶液为最佳提取剂。

2.3.2 提取温度对葵花籽绿原酸得率的影响

不同温度下对绿原酸提取率结果如图4所示。

图4 浸提温度对绿原酸提取率的影响Fig.4 Chlorogenic acid yield effectof extraction temperature

通过分析提取温度对葵花籽粕中绿原酸提取率的影响，从图4可以看出，提取温度在25℃～40℃范围内，绿原酸的提取率随着温度升高而增加，40℃时其提取率值达最高，当温度达到40℃以后，绿原酸的提取率随着温度升高而降低。其原因是绿原酸的邻苯二酚结构不稳定，高温加热易氧化分解。也可能是葵花籽粕中其他成分在高温下溶解出来影响提取效果。因此提取温度以40℃效果最好。

2.3.3 提取时间对葵花籽绿原酸得率的影响

提取时间对绿原酸提取率结果如图5所示。

图5 超声波作用时间对绿原酸提取率的影响Fig.5 Ch lorogenic acid yield effectof extraction time

从图5可以看出，超声时间为30min时绿原酸的提取效果最好。超声时间小于30min时，绿原酸提取率随时间延长呈逐渐增大的趋势。当提取时间超过30min时，绿原酸提取率趋于稳定。因此，综合考虑，超声辅助提取时间以30min为宜。

2.3.4 超声波功率对葵花籽绿原酸得率的影响

不同的超声波功率对绿原酸提取率结果如图6所示。

图6 超声波功率对绿原酸提取率的影响Fig.6 Chlorogenic acid yield effectofultrasonic power

从图6可以看出，随着超声功率的增大，绿原酸的提取率也随增大，最大提取率达到了2.428%。这是因为超声能够产生空化作用，这种空化效应对物料的细胞结构产生破使得有效成分很容易渗出，从而提取率升高。超过300W后，绿原酸提取率明显下降，这可能是因为高功率破坏了葵花籽粕中绿原酸的成分，所以超声最佳提取功率为300W。

2.3.5 料液比对葵花籽绿原酸得率的影响

料液比对绿原酸提取率结果如图7所示。

图7 料液比对绿原酸提取率的影响Fig.7 Chlorogenic acid yield effectof ratio of liquid to solids

从图7可以看出，料液比对绿原酸的提取效果趋于稳定。当料液比在1∶20（g/mL）时，葵花籽粕中绿原酸的提取率略占高峰。继续增大料液比会增加成本，也增大了提取液的浓缩工作。出于节约溶剂、降低成本等因素考虑，料液比的选择不宜太高。因此，通过以上考虑，选择最佳的料液比为1∶20（g/mL）。

2.4 正交试验结果与分析

在单因素试验基础上，以绿原酸得率为指标，选取乙醇浓度、提取时间、提取温度以及超声波功率为考察因素，设计L9（34）正交试验，每项试验重复3次，对超声波辅助提取葵花籽绿原酸工艺进行优化，因素和水平选取见表1，正交试验结果见表2。

表1 正交试验因素水平表Talbe1 Design of factorsand levels in orthogonal test

表2 绿原酸提取工艺正交试验结果分析表Talbe2 Analysisoforthogonal test for Chlorogenic acid extraction processing

由表2可以看出，影响绿原酸提取率的主次因素为乙醇浓度＞超声波功率＞提取温度＞提取时间，即A＞D＞B＞C，试验的最佳提取工艺条件组合为A2B3C1D2，即在乙醇浓度为75%，提取温度40℃，提取时间30min，超声波功率300W的条件下绿原酸提取率为2.43%。此时，绿原酸的提取率达到最大值。

3 结论

1）将绿原酸标准溶液用UV-1700紫外分光光度计在220 nm～440 nm范围内扫描，确定绿原酸标准溶液的最大吸收波长为324 nm。

2）通过单因素和正交试验对超声波辅助提取葵花籽粕中绿原酸工艺条件进行优化，结果表明，在料液比为1∶20（g/mL），乙醇浓度75%，提取温度40℃，提取时间30min，超声波功率300W条件下绿原酸提取率为2.43%，绿原酸提取率达到最大值。

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Extraction Processing of Chlorogenic Acid from Sunflower Seed Kernel

LIYan-hui，TAChang-qing，LIUChao，ZHENG Feng-rong

（Schoolof Food Technology，Jilin Agriculture Science and Technology College，Jilin 132101，Jilin，China）

In thisessay，the extraction processing ofChlorogenic Acid from sunflower seed kernelwas studied. By comparing three extractions，asethanolextraction，microwave extraction，ultrasonic extraction，the optimal was ultrasonic extraction with ethanol as extractant.And four factors，ethanol concentration，extraction time，extraction temperatureand ultrasonic power in thisprocessingwere studied.By single factor testsand orthogonal tests，theoptimalprocessingconditionswereas follows：the influenceorderof these factorsisethanol＞ultrasonic power＞the concentration of extraction temperature＞extraction time，and ethanol concentration was 75%，extraction temperature was 40℃，extraction time was 30 min，ultrasonic power was 300 W.Under these conditions，theproductyield could reached up to2.43%.

sunflower seed kernel；chlorogenic acid；extraction；ultrasonicwave

2014-05-16

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.23.012

吉林省教育厅“十二五”科技项目（吉教科合字[2012]第305号）

李延辉（1969—），男（汉），教授，硕士，主要从事食品加工与安全方面的研究与教学。