建立科研型肝癌肝移植标本库质量控制体系的初步探讨

王乐天，张 庆，郝昱文，陈 虹，陈新国，沈中阳

建立科研型肝癌肝移植标本库质量控制体系的初步探讨

王乐天1，张 庆1，郝昱文2，陈 虹1，陈新国1，沈中阳1

目的 探讨建立科研型肝癌肝移植临床标本库质量控制体系，制定规范化的肝癌肝移植标本采集、处理、保存操作流程及标本信息化管理系统。方法 借鉴国内外建立标本库的标准化程序，制定肝癌肝移植标本库操作流程及质量控制体系，规范化收集、处理及保存肝癌肝移植受者的肿瘤组织及血液标本，同时收集良性肝病肝移植受者以及健康供者的肝组织及血液标本作为研究对照。对所收集的标本及相关的临床资料信息进行系统化管理。结果 自2009-08肝癌肝移植标本库现收集有完整临床资料的501例肝移植供、受者的组织及术前/术后血液标本。其中，肝癌标本包括肿瘤组织、癌旁组织及远端非癌组织标本共计1773份。随机抽取45例标本进行质量监测，显示标本取材的准确率达90%以上，标本质量较好。开发了规范化的标本信息资料计算机管理系统。结论 初步建立了具有一定规模的科研型肝癌肝移植标本库质量控制体系，有利于提高标本的质量，为肝移植研究提供了规范化的临床样本资源平台。

肝细胞肝癌；肝移植；生物样本库；规范化收集；信息化管理

我国是肝癌高发区，患者就诊时多伴有肝炎相关肝硬化。肝移植是目前唯一同时治疗肝癌和肝硬化的有效手段[1,2]。但移植术后肝癌的复发和转移制约了肝移植的发展，深入研究攻克肝癌肝移植术后复发和转移难题势在必行。建立规范化的肝癌肝移植标本库可以最大限度地保护并合理利用肝癌组织标本资源，提供临床标本资源平台，促进肝癌肝移植的研究。鉴于国内尚未建立规范的科研型肝癌肝移植标本库，我们自2009年利用我院肝移植规模处于国内前列的优势，标准化地收集和保存了肝癌肝移植供者和受者的标本。受者的病肝标本包括肝癌组织、癌旁组织、远端非肿瘤组织，并建立了与肝癌标本相关的临床诊治、术后随访等资料及知情同意等伦理资料的信息管理系统，从而初步建立了符合国际规范的肝癌肝移植临床样本库，为肝癌肝移植研究提供了宝贵的临床样本资源。

1 对象与方法

1.1 对象 均为自2009-08在我院住院等待实施肝移植的肝癌患者及终末期良性肝病患者(包括乙肝或丙肝合并肝硬化、自身免疫性肝病、酒精性肝硬化、急性肝衰竭、肝豆状核变性、布加综合征等)。全部病例均经临床化验检查及病理学检查明确诊断。标本库由病理技术员专人负责，熟悉收集流程、熟练掌握标本处理操作规范及质量控制方法。

1.2 主要设备 -86 ℃超低温冰箱 (海尔 DW-86L626 型，规格箱内温度范围-40～-86 ℃，温度波动值≤6 ℃),-40 ℃冰箱(海尔DW-40L262型，规格：箱内温度范围-20～-40 ℃)，6升的液氮罐(YDS-6，静态液氮保存天数≥53 d，四川东亚液氮罐厂),全自动脱水机(规格型号：VIP-6 ，日本樱花SAKURA公司)、石蜡包埋机(规格型号：5232 TEC 5 EM J-2，日本樱花SAKURA公司)、净化工作台(规格型号：SW-CJ-2FD、洁净等级：100级@≥0.5 μm， 苏州净化设备有限公司)、L500低速自动平衡离心机(L500型，规格：最高转速 5000 r/min，总功率 200 W，最短加/减速时间 30 s/25 s，最大相对离心力 4030 g，长沙湘仪离心机仪器有限公司)。

1.3 主要试剂 血液、组织DNA提取试剂盒(德国QIAgen试剂盒)、淋巴细胞分离液(上海恒信化学试剂有限公司产品)、无水乙醇(北京化工厂)、RNAase (美国Omega公司)等。

1.4 标本收集前的准备 肝移植术前征得患者及其家属知情同意,签署知情同意书。由科室住院总医师负责确定标本收集的研究对象及通知采集时间。组织标本由专门负责标本库的病理技术员进行采集，并负责提前准备标记好的冻存管、留取血清和血浆的医用采血管、转移式液氮罐、不锈钢标尺、10%甲醛溶液、照相机、标本资料表等工作。组织标本采集工作在手术室进行，采集器械由手术室提供。

1.5 标本的规范化收集与贮存

1.5.1 新鲜冻存标本收集、处理及保存 当肝癌肝移植受者的完整病肝组织切除离体后，立即用数码相机拍摄大体标本外观(包括标尺，显示肝癌的大小等)，在病肝组织离体后30 min内，除首先留取保证用于病理科进行诊断的足够量肿瘤及癌旁组织标本，将剩余病肝组织按癌组织、癌旁组织(距离肿瘤组织2 cm)和切缘远端非癌组织(距离肿瘤组织>5 cm左右)进行多位点采集。健康供肝组织的标本采集需保证供肝质量及完整性的前提下进行获取，原则上按肝穿活检的组织大小(直径约0.2 cm)在肝边缘处(血管分布较少区域)切取。

1.5.1.1 冻存标本HE染色 HE染色主要用于诊断和检验切取的标本质量是否合格。冷冻样本室温下解冻后脱水、石蜡包埋，制成切片进行HE染色，显示肿瘤组织面积大于70%以上者为合格标本。

1.5.1.2 提取DNA的冻存标本 每例患者的每种组织(癌、癌旁及远端非癌组织)平均切成3～6份标本(根据肿瘤大小)，每份标本的重量原则上在2.5 g左右(直径约0.5 cm，厚度约0.5 cm)， 分别装入2 ml已灭菌标记的冻存管中，并迅速置于转移式液氮罐中，于30 min内再转入-80 ℃超低温冰箱中长期保存。

1.5.1.3 提取RNA的冻存标本 在切取组织(切取组织大小依据病肝肿瘤体积)的时候，为防止 RNA 降解，需快速取下组织，将每块组织用灭过菌的 DEPC水溶液快速冲洗后，迅速装于用0.1%的DEPC水处理过高温灭菌的2 ml冻存管中，快速置于转移式液氮中。于30 min内再转入-80 ℃超低温冰箱中长期保存。切取过程按无菌操作进行，取不同患者标本时应更换刀片及器械。此外，分别取一小块新鲜肝癌组织和癌旁组织(约黄豆大小 )，放入灭菌灭酶的EP管中用于标本入库前的质量检测。

1.5.2 石蜡组织标本收集、处理及保存 选择离体后病肝组织中包含肿瘤及癌旁组织的标本进行切取，或者非肿瘤的病肝(良性肝病合并肝硬化)组织进行切取和固定，24 h后制备成石蜡标本块。石蜡块存放于病理标本柜中常温保存。

1.5.3 血液标本的收集、处理及保存

1.5.3.1 血液标本的收集 血液标本的收集在病房进行，严防标本被异物污染。由责任医师负责准备贴有医院标签及信息的血液采集管，并安排护士采集血液标本。采血在早晨患者进食前进行。采集方式为外周静脉穿刺取血。采集每名患者及健康供肝者术前和术后1 周的血液标本15 ml，其中非抗凝血5 ml、抗凝血10 ml。责任医师负责将采集的血液标本交至标本库技术员，技术员于采血后3 h内完成血液标本的分离和保存。标本处理结束后，由技术员填写血液标本登记表，并注明分离日期、时间、患者信息、标本信息，以及存放方式和具体位置。

1.5.3.2 血液标本的分离及保存 提取血浆及血清方法参照文献[3]。将提取的血清和血浆分装到0.5 ml离心管内，每管约200 μl。低温冷冻保存(-80 ℃冰箱)，登记存档。

提取血液DNA按照试剂盒说明书步骤操作，采用紫外分光光度仪(UVmini-1240)定量。将所有DNA分装及标记编号后，置于-80 ℃保存。

1.6 标本信息化管理 管理人员严格按照标本入库、出库及保存规定进行规范化管理。自行设计并开发信息管理系统应用于肝癌肝移植标本库的管理，系统软件为Windows XP + Microsoft sqlserver2000 +IIS。系统功能录入内容主要有患者信息、供体信息、标本信息、标本使用管理与使用置记、标本质量控制等。

2 结 果

2.1 标本收集 肝癌肝移植标本库现保存有完整临床资料的肝移植供、受者501例肝癌及良性肝病(研究对照)组织及血液标本。其中肝癌标本203例，良性肝病标本214例，健康供肝者84例。肝癌组织标本包括肿瘤组织、癌旁组织、远端正常组织。目前保存了包括肝癌组织、癌旁组织及远端非癌组织标本共计1773份，良性肝病肝硬化组织1320份，正常供肝组织84份。术前共收集肝移植受者血清和血浆均为398份，术后共收集受者血清和血浆分别为181份和179份；术前/术后血液DNA收集分别为356份和162份；术前/术后血液淋巴细胞收集分别为239份和113份。术前收集健康供者血清和血浆均为71份，术前/术后血液DNA收集分别为69份和52份。所收集对象的年龄为2～75岁，平均(47.2±12.1)岁；男437例(占87.2%)，女64例(占12.8%)。

2.2 标本质量监测

2.2.1 取材部位的准确性 笔者抽取45例已收集的新鲜冻存肝癌标本进行HE染色，其中42例包含的肿瘤组织面积≥80%,标本取材的准确率达90%以上；包含的肿瘤组织面积<80%的3例中有2例见肿瘤坏死组织(胞核消失)，考虑可能为术前抗肿瘤局部治疗(肝动脉化疗栓塞及射频消融术)导致部分肿瘤组织坏死，1例为小肝癌，考虑为标本剩余量不足所致。

2.2.2 标本DNA、RNA的提取和鉴定 笔者对收集的冻存组织提取RNA，经紫外分光光度计分析A260/A280 均在1.6～1.8，对总RNA 进行琼脂糖凝胶电泳，发现标本的完整性较好，受检45例冻存组织样本的RNA均可见清晰的28S 及18S 条带，表明有较好的RNA完整性(图1)。此外，利用凝胶电泳实验检测样本DNA的质量，结果显示所有检测的DNA完整性良好，无降解，电泳条带清晰(图2)，能够满足科研实验的要求。以上结果表明本试验中冻存组织标本的取材、处理及保存操作方法及程序可确保标本质量合格。

笔者对采集的外周血液提取DNA和RNA的监测结果显示标本的合格率分别为94%和91%，达到科研实验的要求。少数标本DNA和RNA含量较少考虑可能与肝癌患者外周血中白细胞较低有关。

2.3 肝癌肝移植标本信息化管理系统的建立 制作了适合标准化生物标本库要求且规范化的医用资料计算机管理系统, 建立起包括肿瘤组织标本数据库、血液标本数据库、临床信息数据库、随访资料数据库在内的肝癌肝移植临床标本数据库系统，完成了标本库信息数据管理软件的开发工作。

图1 所收集肝癌冻存组织提取的RNA电泳图

图2 所收集肝癌冻存组织提取的DNA电泳图

3 讨 论

笔者自2009年8月起收集了501例肝癌及良性肝病(作为研究对照)肝移植供、受者的组织标本和血液标本，建立了科研型肝癌肝移植临床标本库。患者在签署知情同意书后,经过专职人员收集移植患者的血液标本和手术摘除病肝组织标本，纳入标本收集数据库系统。血液标本的采集与保存由专职技术人员在相同条件下采集、保存，以避免人为偏差。此外，我所建立了肝移植患者术后随访门诊及随访信息网站，因此具备较完整的患者术后长期随访信息数据，为肝癌肝移植术后复发、转移的诊断及防治领域研究提供了可靠、准确的资源平台。

标本质量控制是建立规范化标本库的关键[3-5]。笔者建立的科研型肝癌肝移植标本库质量控制体系包括完整的硬件设施、规范的操作流程、科学的信息管理系统、准确的临床病理资料、随访系统及专业的技术人员。完整的硬件设施要求具备-80 ℃以下的低温冰箱或液氮保存装置、严格的温控设备和监控设备，防止断电及其他电力故障，避免标本反复冻融。标本的收集严格按照肿瘤组织标本的相关要求和流程进行规范操作，包括取材部位的准确性，组织离体后30 min内将组织置入液氮速冻或-80 ℃深低温冷冻保存等。组织标本的离体时间对于标本的保存质量至关重要。多数学者推荐标本应在切除后30 min内取材并保存[6,7]，以避免基因组DNA～RNA和蛋白的降解。笔者对库存标本进行随机抽样，进行DNA～RNA提取鉴定，证实利用本实验中制定的规范化标准化程序，有利于建立高质量的的肝癌肝移植标本库。标本规范的采集和保存是样本质量符合科学研究的重要条件。为了保证标本库中存放的标本的质量，需要定期抽查组织进行实验，检测标本是否发生降解等质量问题，这是保障标本库质量的重要手段。

本标本库均由指定的病理技术员专人进行标本采集、管理与录入，以保证标本取材的准确性。笔者对收集的组织标本进行抽样检测，标本取材的准确率达90%以上。对于大肝癌或巨大肝癌组织，由于可能存在肿瘤中央组织缺血坏死，故选择肿瘤边缘取材；对于小肝癌及微小肝癌，存在留取病理科送检标本后肿瘤剩余量较少，不够取材新鲜标本和石蜡标本。这种情况下，笔者首先确保石蜡标本的收集。因为石蜡标本保存时间长，操作简便、利用率高。专业的技术和管理人员是标本库质量控制体系关键所在[8]。

笔者制作了规范化的标本信息资料计算机管理系统,通过对501例肝癌及良性肝病肝移植供、受者标本信息的录入和初步分析，检验了该系统拥有完善的数据录入、查询、分析界面，可以提供简单便捷的管理系统，有效提高标本信息管理的准确性和可操作性。此外，由于患者肝移植术后需长期终生随访，本实验中利用我院移植门诊录入的随访信息系统，收录了患者肝移植术后的随访信息，建立了全面、完善的肝癌肝移植标本信息化管理系统。

高质量的临床标本是进行科学研究的先决条件。建立规范化的肝癌肝移植标本库可为肝移植领域研究提供珍贵的临床样本资源，不仅可以充分保护、合理利用肝癌肝移植标本资源，还可确保科研工作的正确性和科学性，对促进肝癌肝移植研究的发展具有十分重要的医学意义。

[1] Vitale A，Volk M，Cillo U. Transplant benefit for patients with hepatocellular carcinoma[J]. World J Gastroenterol, 2013,19(48):9183-9188.

[2] Belghiti J，Fuks D. Liver resection and transplantation in hepatocellular carcinoma[J]. Liver Cancer，2012,1(2): 71-82.

[3] Hughes S，Barnes R O，Watson P H.Biospecimen use in cancer research over two decades[J].Biopres Biobank，2010，8(2)：89-97.

[4] 高 丹，喻晶晶，梁慧芳，等.肝癌生物样本库的建立和质量鉴定[J].实用医学杂志，2013， 29(11)：1734-1735.

[5] Moore H M，Kelly A，Jewell S D，etal.Biospecimen Reporting for Improved Study Quality(BRISQ)[J].J Proteome Res，2011，10(8)：3429-3438.

[6] Mager S R, Oomen M H, Morente M M，etal.Standard operating procedure for the collection of fresh frozen tissue samples[J].Eur J Cancer,2007，43(5): 828-834.

[7] 和 钢，孟庆勇，张 顺，等.肿瘤组织库存标本的质量控制[J].浙江中西医结合杂志,2009，19(7):412-414.

[8] 孙荣国，贾晓蓉.对我国临床标本库建设的建议[J].卫生软科学，2012，26(9)：772-773.

(2014-07-05收稿 2014-07-20修回)

(责任编辑 岳建华)

To establish quality control system of research-based clinical transplantation specimens bank for hepatocellular carcinoma

WANG Letian1, ZHANG Qing1, HAO Yuwen2, CHEN Hong1, CHEN Xinguo1, and SHEN Zhongyang1.

1.Institute of Organ Transplantation, 2.Computer Management Center， General Hospital of Chinese People’s Armed Police Forces, Beijing 100039, China

Objective To study the quality control system for establishment of liver transplantation(LT)biological specimen (bio-specimens) bank for hepatocellular carcinoma(HCC), development of a standardized HCC for LT bio-specimens collection, processing and preservation operation process. To establish at sound and comprehensive information management system to conduct a systematic management of clinical information of collected specimens. Methods Referring to standardized procedures to establish bio-specimens banks, the operational processes system in HCC for LT sample collection and quality control system were developed and standardized. Liver tissue and blood samples of HCC patients for LT were collected, While liver tissue and blood samples of benign liver disease in liver transplant recipients and of healthy donor were collected as a research control. A systematic management of clinical information of specimens collected was conducted. Results From the development of standardized sample collection procedures, in August 2009, and from 501 recipients and donors for LT, specimens of tissues and blood samples were collected. The total number of HCC specimens including tumor tissues, adjacent tissues and remote non-cancerous tissue specimens was 1773. And 45 were randomly selected for DNA and RNA testing; the results proved that the accuracy rate of pathological sampling was above than 90% and these collected specimens had a high quality. HCC specimen information data computer management was established and improved. Conclusions The initial establishment of standardized research-based clinical transplantation specimens bank for HCC is helpful to improving the efficiency of sample collection and quality. It provides a standardized samples resources platform for scientific research in the field.

hepatocellular carcinoma；liver transplantation；bio-specimens bank；standardized collection；information management

国家自然科学基金项目(81372595)；首都临床特色应用研究项目(Z121107001012168)；武警总医院院内资助项目二类(WZ2010027)

王乐天，硕士，主管技师，E-mail: wanglt527@126.com

100039北京，武警总医院：1.肝移植研究所, 2计算机管理中心

张 庆,E-mail: zqy6920@sina.com

R735.3