萝卜下胚轴高效再生体系的建立

李媛媛　王冰林　韩佳　郑慧敏　何珊　胡玉荣　张军

摘要：以7个萝卜品种为试材，开展下胚轴离体培养研究，通过基因型筛选确定具有较高再生频率的萝卜品种进行后续试验，探讨AgNO3浓度、激素配比、琼脂浓度等因素对萝卜下胚轴再生的影响。结果表明：萝卜下胚轴再生的最适培养基为改良MS+1.8 mg/L 6-BA+0.8 mg/L NAA+5 mg/L AgNO3+0.9%琼脂+30 g/L 蔗糖，不定芽再生率高达78.3%，玻璃化率仅为2.8%。

关键词：萝卜；下胚轴；离体再生；AgNO3；激素配比

中图分类号： S631.104.3文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）01-0058-03

收稿日期：2013-05-16

基金项目：山东省优秀中青年科学家科研奖励基金（编号：2007BS06024）；山东省农业良种工程重大课题。

作者简介：李媛媛（1979—），女，山东桓台人，博士，讲师，从事蔬菜遗传育种研究。Tel：（0536）8785690；E-mail：yylilove@126.com。

通信作者：王冰林，博士，副研究员，从事蔬菜遗传育种与栽培生理研究。Tel：（0536）2118661；E-mail：binglinwang@126.com。萝卜是一种重要的营养保健蔬菜，在我国蔬菜栽培和供应中占有重要地位，近几年种植面积不断扩大，产量也在逐步提高，目前全国萝卜栽培面积约为120万hm2/年，总产量达 2 683万t/年[1]。萝卜生产以应用杂交种为主，自交不亲和系和雄性不育系利用是萝卜杂交育种的重要途径，而其传统的保存方法局限性较大。随着生物技术的快速发展，组织培养成为保存和快繁自交不亲和系和雄性不育系的有效途径，同时也是利用基因工程技术选育优良品种的重要前提。萝卜为再生顽拗型植物，再生频率普遍较低[2]，所以建立高效、实用的离体再生体系和组培快繁体系成为萝卜生物技术育种的关键限制因素。因此，笔者选用7个萝卜品种，从基因型、激素配比、AgNO3浓度、琼脂浓度等方面对萝卜下胚轴再生的影响进行了研究，旨在建立高效的萝卜离体再生体系，为利用生物技术与常规育种方法相结合开展萝卜遗传育种和良种繁育提供技术支撑。

1材料与方法

1.1试验材料

供试7个萝卜品种由山东省潍坊市农业科学院提供，分别为杂交种红光102、白玉冠军、潍萝卜1号、潍萝卜2号、潍萝卜3号，常规种潍县萝卜、改良潍县萝卜。

1.2试验方法

1.2.1无菌苗培养挑选颗粒饱满的萝卜种子，用蒸馏水清洗干净后用滤纸吸干。在超净工作台上用70%乙醇处理 30 s，再用0.1%氯化汞处理8 min，无菌水冲洗4～5遍，然后接种于1/2MS培养基（含20 g/L 蔗糖+7.5 g/L 琼脂，pH值 5.8～6.0）上。每个三角瓶接种5～10粒种子，置于25 ℃、光照时间16 h/d、光照强度2 000 lx条件下培养，获得无菌苗。

1.2.2不定芽诱导切取生长4～5 d的无菌苗下胚轴（切段长5～10 mm），接种于改良培养基（MS+5 mg/L 6-BA+ 0.2 mg/L NAA+7.5 g/L 琼脂+30 g/L 蔗糖）上，每瓶接种 4～5个外植体。在温度25 ℃、光照时间16 h/d、光照强度 2 000 lx 条件下培养15～20 d，统计不定芽再生率及玻璃化率，选出再生频率较高的萝卜基因型。以再生情况最好的基因型为材料，筛选合适的激素（6-BA和NAA）浓度配比、AgNO3 浓度和琼脂浓度。愈伤再生率=（形成愈伤的外植体数/接种的外植体总数）×100%；愈伤褐化率=（褐化的愈伤数/愈伤总数）×100%；不定芽再生率=（形成再生芽的外植体数/接种的外植体总数）×100%；玻璃化率=（玻璃化芽数/芽总数）×100%。

1.2.3不定根诱导外植体培养15～20 d后，愈伤组织基本脱分化出不定芽，将不定芽切割成小块，接于1/2MS基本培养基上诱导生根。

2结果与分析

2.1不同基因型对萝卜下胚轴再生的影响

在改良培养基（MS+5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+7.5 g/L 琼脂+30 g/L 蔗糖）上培养5 d左右，萝卜下胚轴两端开始膨大，10 d左右形成明显的愈伤组织，15 d左右长出不定芽。在供试的7个萝卜品种中，改良潍县萝卜不定芽再生率最高，达48.2%，其次为潍萝卜3号，其他品种不定芽再生率较低，且愈伤褐化率、玻璃化率偏高；白玉冠军虽然愈伤再生率最高，但未长出不定芽（表1），所以选择改良潍县萝卜为试材进行后续试验，图1为该品种下胚轴离体培养各阶段的生长状况。

2.2不同AgNO3浓度对萝卜下胚轴再生的影响

由表2可知，在培养基中添加AgNO3可提高改良潍县萝卜品种下胚轴愈伤再生率和不定芽再生率，而降低愈伤褐化率和玻璃化率，且随着浓度增加，变化幅度加大。鉴于AgNO3对植物生长具有毒害作用，浓度过高会抑制萝卜不定芽生长，宜选择5 mg/L。

3结论与讨论

萝卜是再生顽拗型植物，基因型对萝卜再生能力影响较大[3-5]。在本研究所用的7个萝卜品种中，改良潍县萝卜下胚轴再生率达到48.2%，而白玉冠军下胚轴再生率为0，品种间存在较大差异。王洋等认为，对于具有高频再生潜力的基因型，通过改良培养基能够建立一个高频再生体系[6]。所以，改良潍县萝卜可作为下胚轴再生的较理想基因型。

关于萝卜离体再生的研究较少，主要以子叶和下胚轴为外植体。徐文玲等以萝卜带柄子叶为外植体，建立了再生率较高的再生体系[2，7-8]。在早期，崔群香等对萝卜下胚轴离体再生进行了初步探讨，但对离体再生的影响因素及不定芽再生率缺乏系统研究[9-10]。王辉等将诱导出的45块愈伤组织进行培养，仅分化出3个芽，再生率很低[11]。本研究以再生频率较高的改良潍县萝卜品种为试材，系统研究了AgNO3浓度、激素配比、琼脂浓度等因素对萝卜下胚轴再生的影响，建立了萝卜下胚轴愈伤诱导率100%、不定芽再生率78.3%、玻璃化率仅为2.8%的高效再生体系，其最适改良培养基为 MS+1.8 mg/L 6-BA+0.8 mg/L NAA+5 mg/L AgNO3+ 9 g/L 琼脂+30 g/L 蔗糖，这为利用生物技术进行萝卜育种和制种工作奠定了良好基础。

参考文献：

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