血管内皮生长因子-β在人绒毛膜癌中的作用研究

伍彩雯 杨 采莲 王 永荣 高新明

绒毛膜癌其病理成分主要为合体滋养细胞和细胞滋养细胞，属于恶性程度极高的肿瘤，缺少绒毛组织，极易出现早期转移，特别是早期肺部转移，化疗对该病具有良好的作用，但是在长期的化疗过程中患者会出现严重的副反应和脑转移等情况，因而病死率较高［1，2］。血管内皮生长因子-β(VEGF-β) 即血管内皮生长因子-B，属于血管内皮生长因子家族，可通过与样酪氨酸激酶-1的结合而发生作用。研究认为VEGF-β可通过影响内皮型一氧化氮合酶(eNOS)来介导肿瘤新生［3］。有关研究指出VEGF-β主要在胰腺癌、乳腺癌、结肠直肠癌等恶性肿瘤的边缘呈现高表达，而在正常人血浆中只有少量表达，因此VEGF-β与肿瘤细胞的侵袭力密切相关［3］。但是目前相关的研究和报道并不多见，本文以人绒毛膜癌株JAR和JEG-3为模型，观察VEGF-β mRNA的表达与人绒毛膜癌的关系，为临床基因治疗绒毛膜癌转移提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料来源 细胞株:JAR来自于中国科学院上海细胞所，JEG-3来自于中国科学院动物研究所计划生育及生殖生物学国家重点实验室。

1.2 试剂 Falcon公司的15 ml和10 ml一次性离心管和一次性移液管、6well细胞培养板、25 cm2一次性细胞培养瓶;Eppendorf公司的1.5 ml eppendorf管和9600PCR管;TaKara公司的25 mmol/L MgCl2和10*PCR buffer及10 mmol/L dNTP Mix;上海生物工程技术服务有限公司的Taq DNA Polymerase;SABC公司的DNA分子量标准入DNA/Hindl;Takara公司的DNAMarkerDL2000及RT-PCR试剂盒;promega公司的Reverse Transcription system Kit、溴化乙锭(EB);Invitrogen公司的lipofeetamineTM2000;Sigma公司的焦碳酸二乙酉旨(DEPC)、普通琼脂糖(agarose);天津濒洋生物制品有限公司的苯酚;湖南师范大学化学试剂厂的无水乙醇、三氯甲烷、异丙醇;Gibco BRL公司的Trizol;Difco公司的胰酶;GIBCO公司的RPMI-1640细胞培养基;杭州四季青生物技术公司的小牛血清;Coming Costar公司的Transwell侵袭小室(24孔板，滤膜孔径8 μm);北京大学细胞生物学系Matrigel凝胶(3.5 μg/μl);invitrogen 公司的阳离子脂质体转染试剂LipofectamineTM2000;武汉晶赛生物工程技术有限公司的针对人VEGF-β基因的靶向shRNA及Fermentas公司的25 mmol/L MgCl2、10 mmol/L dNTP Mix、Taq DNA Polymerase［4，5］。仪器包括制冰机、PCR 仪、Gel Doc1000凝胶成像分析系统、微量加样器、电动移液器、－80℃冰箱、高速离心机、微波炉等。晶赛公司以VEGF-β为靶基因涉及的DNA两条序列，以转染的shRNA为阴性对照组，反义序列:5’-AAAGGACAGUGCUGUGAAGCCAGACAA-3’正 义 序 列:5’-AAUUUCCUGUCACGACACUUCGGUCUG-3’PCR 扩增引物序列见表1。

表1 PCR扩增引物序列

1.3 方法 将两种细胞分别在饱和湿度、温度37℃、95%空气和5%CO2的培养环境中于10%小牛血清RPMI-1640培养液中培养，培养液1～2 d更换1次，细胞繁殖近瓶底70%～80%时传代1次。

1.4 统计学分析 应用SPSS 13.0统计软件，计量资料以±s表示，采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两种细胞侵袭力差异 在进行Matrigel体外侵袭力的实验中，细胞侵袭力通过Transwell膜的透过情况来衡量，研究结果显示JAR细胞零散分布于Transwell膜，且数量较少，而JEG-3细胞穿过Transwell膜的数量较多，分布较为密集，经比较两者差异有统计学意义(P ＜0.05)。见表2。

表2 两种细胞侵袭力比较±s

表2 两种细胞侵袭力比较±s

组别 透膜数 试验次数 t值 P值JAR 105 ±15 5 12.729 ＜0.05 JEG-3 218±13 5

2.2 JAR、JEG-3中VEGF-β mRNA 差异的PT-PCR 检测 研究合成VEGF-β引物，经图像分析系统分析，计算GAPDH和VEGF-β的光密度值，结果显示JEG-3细胞内VEGF-β mRNA明显高于JAR细胞，差别有统计学意义(P ＜0.05)。见表3。

表3 JAR、JEG-3中VEGF-β mRNA差异的PT-PCR检测±s

表3 JAR、JEG-3中VEGF-β mRNA差异的PT-PCR检测±s

组别 VEGF-β mRNA 试验次数 t值 P值JAR 0.472 ±0.04 5 31.3 ＜0.05 JEG-3 1.724 ±0.08 5

2.3 转染后3组细胞内VEGF-β mRNA情况 研究显示转染shRNA在JEG-3的细胞抑制方面具有明显的作用，与对照组和非特异性shRNA相比，差异有统计学意义(P＜0.05)，对照组与非特异组间比较差异无统计学意义(P ＞0.05)。见表4。

表4 转染后各组细胞内VEGF-β mRNA情况±s

表4 转染后各组细胞内VEGF-β mRNA情况±s

注:与试验组比较，*P ＜0.05

组别 VEGF-β mRNA 灰度值 试验次数试验组(shRNA)0.43 ±0.04 5对照组(空白对照) 1.68 ±0.08* 5非特异 shRNA 组 1.68 ±0.09*5

2.4 转染后3组侵袭力差异 以Matrigel体外侵袭实验获得的Transwell膜细胞数来反应侵袭力强弱，研究显示，试验组较对照组和非特异组穿膜数量明显减少，差异有统计学差异(P ＜0.05)。见表5。

表5 转染后各组侵袭力差异±s

表5 转染后各组侵袭力差异±s

注:与试验组比较，*P ＜0.05

组别 穿膜细胞数 试验次数试验组(shRNA)106±9 5对照组(空白对照) 223±11* 5非特异组shRNA组 215±13*5

3 讨论

人类滋养细胞与体细胞的特殊细胞不同，它具有特殊的生物学特性和繁殖特点，正常妊娠的滋养细胞受时间和空间的调控呈现一定的侵袭力，而当发生妊娠滋养细胞瘤时，此时滋养细胞则失去时间和空间的控制，特别是绒毛膜癌，侵袭转移和播散的能力特别强。目前研究认为，正常的滋养细胞侵袭对维持妊娠顺利进行具有重要作用，但是当侵袭不收控制时，将会导致一些列妇科妊娠相关疾病，严重者危及患者生命［6，7］。目前由于化疗过程中出现的副反应和脑转移严重制约了该疾病的治疗，因此降低绒毛膜癌的侵袭力，控制和防止其转移能力则成为临床医学界的一大难题，本研究经过试验证明JEG-3的侵袭力远远高于JAR细胞，且差异有统计学意义(P ＜0.05)，这提示VEGF-β有可能是绒毛膜癌侵袭的重要因子，这与相关研究相似，而有研究认为VEGF-β会通过促进癌细胞增殖、增加瘤供血能力和运动能力及癌细胞基底膜穿透能力来参与绒毛膜癌的侵袭和转移过程，shRNA则对 JEG-3的侵袭起到了抑制的作用［7］。总之，VEGF-β可以增加人绒毛膜癌的侵袭力，而VEGF-β shRNA则对其侵袭力起到了一定的抑制作用，因此在人绒毛膜癌的治疗中VEGF-β的治疗，将成为该病新的治疗方式。

1 段娥，王芳，李英勇.1α，25-二羟基维生素D3对绒毛膜癌细胞株JAR的影响及其机制.现代妇产科进展，2011，20:614-617.

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5 王慧敏，唐均英.原发性输卵管绒毛膜癌1例并文献回顾.四川医学，2013，34:783-784.

6 徐小燕，庞义存.绒毛膜癌肺转移并发呼吸衰竭2例及文献复习.河北医科大学学报，2013，34:476-479.

7 张卓，李玉红，许倩.不同剂量IL-12对绒毛膜癌JEG-3细胞增殖的影响.临床和实验医学杂志，2011，10:161-162，164.