错配修复基因(MMR)蛋白在子宫内膜非典型增生中的表达及其意义

古丽米拉·巴依坦， 余 丽， 师晓莉， 张 巍， 苗 娜

(1新疆人口和计划生育科研所病理科， 乌鲁木齐 830011； 2新疆昌吉市第二人民医院病理科， 新疆 昌吉 831100；3新疆医科大学第一附属医院病理科， 乌鲁木齐 830054)

子宫内膜非典型增生(endometrial atypical hyperplasia)被认为是子宫内膜样腺癌的前驱病变[1]，通常经历子宫内膜复杂型增生、非典型增生和癌的演变过程。研究显示DNA错配修复基因(DNA mismatch repair gene，MMR)系统对人体细胞中遗传物质的完整性和稳定性起着极为重要的作用。MMR基因能特异性地识别和修复DNA复制过程中出现的碱基错配。目前国内外有关MMR系蛋白在子宫内膜非典型增生中变化的研究较少。本研究对50例子宫内膜非典型增生组织中微卫星不稳定性(microsatellite instability，MSI)状态与临床特征的关系进行分析，探讨MSI在子宫内膜非典型增生中的表达意义。

1 材料与方法

1.1一般材料随机收集新疆医科大学第一附属医院病理科2006年8月-2013年5月子宫内膜非典型增生标本50例，其中全子宫切除术标本9例，子宫内膜活检标本41例。标本均经10%的中性福尔马林固定，石蜡包埋。患者年龄29～71岁，平均年龄45.6岁。组织切片由2名高年资病理医师复阅，按照2004年版《女性生殖道病理学》[2]，子宫内膜非典型增生病理学诊断标准根据腺上皮细胞异型、腺体的结构及间质的改变进行形态学诊断，准确筛选子宫内膜非典型病例。另收集正常增生期子宫内膜50例标本设为对照组。

1.2子宫内膜非典型增生的形态学诊断标准腺上皮细胞大小不等，复层排列、极向较紊乱；核大，染色质粗糙、深染，核仁明显，核分裂象增多；胞质丰富、淡染或嗜酸性。腺体“迷宫”样排列及背靠背现象。腺体∶间质>3∶1；泡沫细胞增多；无异型细胞的浸润。

1.3实验试剂单克隆鼠源性抗体， MLH1(1∶80)、PMS2( 1∶40)、MSH2 (1∶100)、 MSH6(1∶200)均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.4方法采用免疫组化EnVision二步法，病变周围正常子宫内膜、间质细胞和淋巴细胞作为内对照，实验步骤严格按照试剂盒说明操作。

1.5结果判断标准MMR蛋白正常表达在细胞核和细胞质均可着色。阳性诊断标准为细胞核、细胞质同时出现棕黄色颗粒，病变区域细胞核、细胞质均无着色可判断为阴性(失表达)。非肿瘤性的内膜间质及淋巴细胞核阳性作为内对照。MSI结果判定标准：错配修复基因(MMR)中出现2～3个MMR蛋白表达缺失者为高频微卫星不稳定性(high level of microsatellite instability，MSI-H)，只有1个 MMR蛋白表达缺失者为低频微卫星不稳定性 (Low level of microsatellite instability，MSI-L)，4个MMR均为阳性者为微卫星稳定性(microsatellite stability，MSS)。

1.6统计学处理采用SPSS17.0统计软件行统计学分析，MMR系蛋白在各组间表达的比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1两组MMR系中MLH1、MSH2、PMS2、MSH6蛋白失表达情况MLH1、MSH2、PMS2和MSH6蛋白在子宫内膜非典型增生组织中失表达率分别为12%(6/50)、14%(7/50)、 12%(6/50)、 8%(4/50)。MSH2在50例正常增生期子宫内膜组中失表达率为8%(4/50)，其他3种蛋白均无出现失表达。MLH1、PMS2、MSH6在子宫内膜非典型增生中失表达率高于正常增生期子宫内膜，两组差异具有统计学意义(P<0.05)，两组MSH2表达差异无统计学意义(P=0.338)(表1、图1)。

2.2两组MSI(MSI-H、MSI-L)与MSS表型子宫内膜非典型增生组MMR蛋白失表达所致的MSI-H表型7例(14%)，MSI-L表型9例(18%)，MSS表型34例(68%)，与正常增生期子宫内膜组相比较，差异具有统计学意义(P=0.005)(表2)。

2.3子宫内膜非典型增生组织中MSI(MSI-H、MSI-L)表型与患者年龄的关系年龄≤50岁和>50岁子宫内膜非典型增生患者中微卫星不稳定性差异具有统计学意义(P=0.001)(表3)。

a: MLH1蛋白在宫内膜非典型增生组织腺上皮细胞核阴性表达

b: MSH6蛋白在增生期子宫内膜组织腺上皮细胞核呈棕黄色阳性表达

表1 两组MMR蛋白的表达情况/例(%)

表2 两组MSI(MSI-H、MSI-L)和MSS状态/例(%)

表3 子宫内膜非典型增生病变中的MSI(MSI-H、MSI-L)和MSS状态与年龄的关系/例

3 讨论

MMR系统最初于大肠杆菌中被发现，迄今为止已分离鉴定9种人类同源MMR基因，其中能参与MMR作用或识别错配碱基及新生DNA链的基因组主要为MLH1、MSH2、PMS2和MSH6，该MMR系在维持基因稳定性方面发挥着重要作用。细胞正常复制过程中DNA靠A-T、 G-C之间的氢键互补配对来维持螺旋结构，而MMR(MLH1、MSH2、PMS2、MSH6)系主要是能识别和修复DNA复制中的错配碱基，降低基因突变，保证遗传保守性和稳定性。

微卫星不稳定性是癌基因和抑癌基因之后，肿瘤分子发病机制的又一重大进展，是一种肿瘤形成的机制[3]。一般表现为编码区基因突变或蛋白失表达，失去对损伤进行修复功能。有关肿瘤发病机制的研究发现，MSI表型肿瘤中频繁出现MMR基因突变或功能蛋白缺失，MSI检测已经成为筛选错配修复基因突变肿瘤的一种重要方法，MMR基因丧失错配修复功能时DNA复制过程中出现的碱基错配和缺失不能被修复，表现为高度微卫星不稳定性(high level of microsatellite instability，MSI-H)[4]。另外有研究显示，结直肠癌等肿瘤中MSI-H表型的生物学行为及预后等与MSS/MSI-L表型肿瘤存在显著差别[5-6]。当前研究普遍认为子宫内膜癌是由正常子宫内膜复杂型增生至非典型增生病变逐步发展而来的。不典型增生妇女若不经治疗则有20%～52%的病例可发展为子宫内膜癌[1]。子宫内膜在各种刺激因素作用下增生活跃时，组织中DNA复制频繁，碱基错配率增多，功能区MMR基因突变导致蛋白缺陷。

Wang等[7]的动物实验研究发现，PTEN(属于抑癌基因，位于10q23.3)突变的子宫内膜不典型增生小鼠如果合并MLH1突变，短时间内发生癌变，表明错配修复基因MLH1突变可以促进子宫内膜癌的发生。本研究显示，MMR(MLH1、MSH2、PMS2、MSH6)蛋白在子宫内膜非典型增生组织中的失表达率分别为12%(6/50)、14%(7/50)、12%(6/50)、8%(4/50)；MSH2在正常增生期子宫内膜组织中失表达率为 8%(4/50)；MLH1、PMS2、MSH6在子宫内膜非典型增生组的失表达率显著高于正常增生期子宫内膜组(P<0.05)，而两组MSH2的失表达差异无统计学意义(P=0.338)，提示非典型增生病变有恶变的倾向；MMR蛋白在正常的子宫内膜中具有修复错配碱基的作用，而非典型增生组织中有不同程度的蛋白失表达，表明在子宫内膜异常增生时MMR蛋白缺失引起错配修复功能的降低或丧失，增加肿瘤易感性[8]。

Sherman等[9]研究表明，子宫内膜非典型增生和子宫内膜样腺癌具有相似的分子生物学改变。微卫星不稳定性(MSI)出现于28%的非典型增生病变和子宫内膜样腺癌中。本研究通过4种蛋白失表达率检测非典型增生子宫内膜组织中的 MSI表型为32%(16/50)，略高于文献[9]报道结果,其中子宫内膜非典型增生组MSI-H(7/50)、MSI-L(9/50)表型高于正常增生期子宫内膜组MSL-L(4/50)，差异有统计学意义(P=0.005)。有关子宫内膜癌前病变的微卫星不稳定性研究显示， MSI表型的内膜腺癌组织周围的非典型增生病变也为MSI表型，子宫内膜腺癌和内膜非典型增生病变属于同一谱系[10]，MSI表型内膜非典型增生性病变更易通过连续的克隆性变化发展为癌。

发病年龄是肿瘤研究中的重要因素，因而癌前病变发展为癌之前，通过对高危年龄组人群进行基因检测筛选MMR基因突变者，可实现肿瘤相关的预防措施及早期诊断[11]。研究显示，子宫内膜非典型增生患者平均年龄为(50±11)岁[12]，多处于围绝经期。本组患者平均年龄为45.6岁。本研究进一步分析了微卫星不稳定性与内膜非典型增生患者年龄的关系，年龄≤50岁者MSI-H和MSS表型高于年龄>50岁者，相反，>50岁者MSI-L表型高于≤50岁者，但差异均有统计学意义(P=0.001) 。目前认为MSI-H是一个独立群体[13]，在低分化肿瘤中的比率高，并且预后差。本研究结果验证了在子宫内膜非典型增生中所检测到的MSI-H与患者年龄的相关性。但目前研究对MSI-L的所占比例和其特点还不是很清楚，主要是对MSI-L的定义尚不是很明确，在研究中对MSI-L判定标准差异很大，因此有待于进一步研究。

综上所述，MMR蛋白失表达及MSI(MSI-H)可能是子宫内膜非典型增生的分子事件，了解MSI-H表型在子宫内膜非典型增生中的表达及意义，可为病变的预防与早期诊断提供更多信息。

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