犬腹泻病原菌的分离鉴定及药物敏感性分析

李淑红等

摘要：对湖南常德地区5例犬腹泻病直肠粪便采样，进行细菌分离鉴定；用世界卫生组织（WHO）推荐的Kirby-Bauer氏法对分离菌株进行药敏试验，筛选抗致病菌的敏感药物。结果表明，5例样本中分离鉴定出4株沙门氏菌、5株大肠埃希菌，分离率分别为44.44%、55.56%。分离株沙门氏菌对新霉素、卡那霉素、妥布霉素、复方新诺明、庆大霉素等5种药物敏感，对多黏菌素B、四环素2种药物中介，对其余10种药物耐药；分离株大肠埃希菌对红霉素、妥布霉素、复方新诺明3种药物敏感，对卡那霉素、呋喃妥因、多黏菌素B、庆大霉素4种药物中介，对其余10种药物耐药。

关键词：犬；大肠埃希菌；沙门氏菌；分离；药敏试验

中图分类号：S858.292.51 文献标志码：A 文章编号：1002-1302（2014）04-0170-02

收稿日期：2013-07-19

基金项目：湖南省高校重点实验室项目（编号：2008）；2011年湖南省“十二五”重点建设学科项目（编号：2011）；湖南省高校创新平台开放基金（编号：10K043）；湖南省重点实验室项目（编号：2012）；湖南省科学技术厅计划项目（编号：2013FJ3018）；湖南省常德市科技局项目（编号：2013NK02）。

作者简介：李淑红（1964—），女，山东禹城人，硕士，教授，从事动物科学专业教学与研究。E-mail：wangren6332@163.com。腹泻是临床上多种疾病经过中表现的主要症状之一，是具有腹泻症状疾病的统称，可导致犬营养不良、生长发育障碍和工作能力丧失，幼龄犬发生率和死亡率均很高[1]。病犬表现排便次数明显增多，粪便稀薄如水样或稀粥样。由细菌引起犬腹泻较常见，犬的肠道内有大量潜在的致病菌，但不是每种细菌都与临床疾病有明确的联系。引起犬肠道感染的致病菌包括肠致病性大肠埃希菌、无致病性大肠埃希菌、沙门氏菌属病菌、小肠结肠炎耶尔森菌、弯曲菌属病菌、毛状芽孢杆菌、梭菌属病菌、葡萄球菌和志贺菌属病菌[2]。其中，以大肠埃希菌最常见，其次为犬沙门氏菌，沙门氏菌病别称副伤寒，是由沙门氏菌属细菌引起的人畜共患病[3]。本试验通过对5例犬腹泻病粪便进行采样、分离鉴定、革兰氏染色镜检、生化试验，并对分离株进行药敏试验，筛选抗致病菌的敏感药物，为临床用药和治疗犬腹泻病提供参考。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1药品牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、氢氧化钠、蒸馏水、无菌水；结晶紫、番红、碘液、香柏油、二甲苯、95%乙醇等。11种肠埃希菌属细菌生化编码鉴定管由浙江省杭州微生物试剂有限公司生产。营养琼脂（NA）、麦康凯培养基（MAC）、伊红-美蓝培养基（EMB）、SS琼脂培养基、亚硫酸铋琼脂（BS）成品均由浙江省杭州天和微生物试剂有限公司生产；营养肉汤（NB）、革兰氏染色试剂由微生物实验室配制。

1.1.2药敏纸片药敏纸片为浙江省杭州天和微生物试剂有限公司采用美国NCCLS最新药敏试验法规制备的标准厚纸片，直径6.35 mm，纸片含药量符合标准。本试验共选用17种药物敏感试纸，包括新霉素（新）、羧苄青霉素（羧）、氨苄青霉素（氨）、头孢拉定（VI）、卡那霉素（卡）、先锋霉素V（V）、阿莫西林（莫）、四环素（四）、红霉素（红）、万古霉素（万）、妥布霉素（妥）、复方新诺明（复）、呋喃妥因（呋）、萘啶酸（萘）、链霉素（链）、庆大霉素（庆）、多黏菌素B（多）。

1.1.3主要仪器电子天平、生物显微镜、恒温培养箱、立式压力蒸汽灭菌器、干燥箱、无菌操作台、微量移液器等。

1.1.4病料来源湖南省常德市城西宠物医院提供5只腹泻犬，其中有3只丝毛犬、1只中华田园犬、1只小型猎犬。

1.2方法

1.2.1培养基配制营养肉汤的配制：称量10 g蛋白胨、5 g牛肉膏、5 g氯化钠，混合溶解于1 000 mL蒸馏水中并煮沸，校正pH值至7.0～7.2，装于锥形瓶中经121 ℃灭菌 15 min，冷藏备用[4]。营养琼脂（NA）、麦康凯培养基（MAC）、伊红-美蓝培养基（EMB）、SS琼脂培养基、亚硫酸铋琼脂（BS）成品按说明配制，备用。

1.2.2病料的采集用无菌棉拭子插入病犬直肠，旋转取其粪便，迅速放入装有灭菌营养肉汤的5支试管内，封盖贴标签，放入37 ℃恒温箱中增菌培养18～24 h。

1.2.3细菌的分离培养取少量用肉汤培养基培养24 h的菌液，在NA培养基上划线分离，置于37 ℃恒温箱中培养 18～24 h，再挑取单菌落在普通琼脂培养基上划线分离、培养。如此反复，直到培养基上的菌落特征相同时，再挑取单个菌落涂片，染色并镜检[5]，观察菌体大小、染色特征；并分别接种于EMB、MAC、SS、BS培养基上，观察菌落生长、形态、颜色、色泽、大小等。

1.2.4生化试验将疑似大肠埃希菌和沙门氏菌的细菌接种到细菌生化测定成套试剂微量管中，37 ℃恒温箱培养18～24 h，观察并记录结果。

1.2.5药敏试验选用17种药物敏感试纸，采用目前各实验室广泛采用的世界卫生组织推荐的纸片琼脂扩散法（disc agar diffusion）即Kirby-Barere法，挑取1/2个已分离鉴定的菌落接种于含5 mL营养肉汤的试管中，置37 ℃恒温箱中培养18～24 h，取出，与麦氏标准管进行比较。若肉汤浊度不够，则继续培养；若肉汤浊度过高，则用灭菌生理盐水稀释调节至与0.5麦氏标准管浊度相同。取直径90 mm的平皿，琼脂厚度约4 mm，用移液枪取菌液200 μL于营养琼脂培养基中心，用刮铲从中心开始推平菌液，使菌液遍布培养皿的每个角落，用镊子夹取药敏纸片，每隔2 cm轻贴于培养基上，完成后于37 ℃恒温箱中培养18～24 h，用游标卡尺测量抑菌圈直径，重复3次，记录结果[6]。根据被测药物按常用剂量、给药时间在体内能达到的血药浓度将敏感性标准分为3级：敏感（S）、中介（I）和耐药（R）。抗菌药纸片种类、含药量及判定标准参照文献[7]（表1）。endprint

2结果与分析

2.1犬腹泻病肠道细菌分离鉴定结果

自5只病犬分离的细菌在NA、EMB、MAC、SS、BS培养基上的菌落形态特征及涂片染色镜检结果见表2。

将分离的菌株按常规方法分别接种于葡萄糖、赖氨酸、鸟氨酸、硫化氢、靛基质、乳糖、卫矛醇、苯丙氨酸、尿素、氨对微量生化管中，于37 ℃培养18～24 h，观察并记录生化反应结果（表3）。

3结论与讨论

药敏试验结果表明，在17种抗菌药物中，沙门氏菌对新霉素、卡那霉素、妥布霉素、复方新诺明、庆大霉素5种药物敏感，对多黏菌素B、四环素2种药物中介，对其他10种药物耐药。大肠埃希菌对红霉素、妥布霉素、复方新诺明3种药物敏感，对卡那霉素、呋喃妥因、多黏菌素B、庆大霉素4种药物中介，对其他10种药物产生了耐药性。犬沙门氏菌和大肠埃希菌产生广泛的耐药不敏感现象，可能与近几年抗生素药物在临床上的广泛应用有关，导致细菌遗传性状变异，产生耐药质粒。在疾病治疗中，按规定剂量、规定方法和疗程用药，切勿乱用药，这是避免耐药菌株继续增多的根本方法[8]。因此，在临床选药治疗犬病时，应根据病情结合药敏试验结果合理选药。根据本次细菌分离及药敏试验结果在临床治疗常德地区大肠埃希菌和沙门氏杆菌引起的犬腹泻病时，可首选妥布霉素药、复方新诺明、卡那霉素、萘啶酸、庆大霉素、新霉素、红霉素等对细菌敏感性高的药物，以提高疗效，降低细菌对抗生素耐药性的产生。

参考文献：

[1]王代宾，张艳丽，王立芬. 犬腹泻病的危害及其诊治[J]. 养殖技术顾问，2011（10）：138-138.

[2]张丽，肖啸，沈学文. 犬细菌性腹泻的细菌分离培养与鉴定[J]. 山东畜牧兽医，2012，33（6）：1-4.

[3]武守艳，韩一超，陈剑波，等. 犬沙门氏菌病的诊治[J]. 中国兽医杂志，2006，42（6）：18

[4]杜连祥，路福平. 微生物学实验技术[M]. 北京：中国轻工业出版社，2005.

[5]陆承平. 兽医微生物学[M]. 北京：中国农业出版社，2001：223-225，215-216.

[6]倪语星. 细菌耐药性监测与抗感染治疗[M]. 北京：人民军医出版社，2002.

[7]M100-S14抗微生物药物敏感性试验执行标准：第14版信息增刊[S]. 华盛顿：美国临床和实验室标准协会，2004.

[8]朱忠珂，范国英，钟华. 犬大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验[J]. 黑龙江畜牧兽医，2012，8（16）：93-94.endprint

2结果与分析

2.1犬腹泻病肠道细菌分离鉴定结果

自5只病犬分离的细菌在NA、EMB、MAC、SS、BS培养基上的菌落形态特征及涂片染色镜检结果见表2。

将分离的菌株按常规方法分别接种于葡萄糖、赖氨酸、鸟氨酸、硫化氢、靛基质、乳糖、卫矛醇、苯丙氨酸、尿素、氨对微量生化管中，于37 ℃培养18～24 h，观察并记录生化反应结果（表3）。

3结论与讨论

药敏试验结果表明，在17种抗菌药物中，沙门氏菌对新霉素、卡那霉素、妥布霉素、复方新诺明、庆大霉素5种药物敏感，对多黏菌素B、四环素2种药物中介，对其他10种药物耐药。大肠埃希菌对红霉素、妥布霉素、复方新诺明3种药物敏感，对卡那霉素、呋喃妥因、多黏菌素B、庆大霉素4种药物中介，对其他10种药物产生了耐药性。犬沙门氏菌和大肠埃希菌产生广泛的耐药不敏感现象，可能与近几年抗生素药物在临床上的广泛应用有关，导致细菌遗传性状变异，产生耐药质粒。在疾病治疗中，按规定剂量、规定方法和疗程用药，切勿乱用药，这是避免耐药菌株继续增多的根本方法[8]。因此，在临床选药治疗犬病时，应根据病情结合药敏试验结果合理选药。根据本次细菌分离及药敏试验结果在临床治疗常德地区大肠埃希菌和沙门氏杆菌引起的犬腹泻病时，可首选妥布霉素药、复方新诺明、卡那霉素、萘啶酸、庆大霉素、新霉素、红霉素等对细菌敏感性高的药物，以提高疗效，降低细菌对抗生素耐药性的产生。

参考文献：

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[7]M100-S14抗微生物药物敏感性试验执行标准：第14版信息增刊[S]. 华盛顿：美国临床和实验室标准协会，2004.

[8]朱忠珂，范国英，钟华. 犬大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验[J]. 黑龙江畜牧兽医，2012，8（16）：93-94.endprint

2结果与分析

2.1犬腹泻病肠道细菌分离鉴定结果

自5只病犬分离的细菌在NA、EMB、MAC、SS、BS培养基上的菌落形态特征及涂片染色镜检结果见表2。

将分离的菌株按常规方法分别接种于葡萄糖、赖氨酸、鸟氨酸、硫化氢、靛基质、乳糖、卫矛醇、苯丙氨酸、尿素、氨对微量生化管中，于37 ℃培养18～24 h，观察并记录生化反应结果（表3）。

3结论与讨论

药敏试验结果表明，在17种抗菌药物中，沙门氏菌对新霉素、卡那霉素、妥布霉素、复方新诺明、庆大霉素5种药物敏感，对多黏菌素B、四环素2种药物中介，对其他10种药物耐药。大肠埃希菌对红霉素、妥布霉素、复方新诺明3种药物敏感，对卡那霉素、呋喃妥因、多黏菌素B、庆大霉素4种药物中介，对其他10种药物产生了耐药性。犬沙门氏菌和大肠埃希菌产生广泛的耐药不敏感现象，可能与近几年抗生素药物在临床上的广泛应用有关，导致细菌遗传性状变异，产生耐药质粒。在疾病治疗中，按规定剂量、规定方法和疗程用药，切勿乱用药，这是避免耐药菌株继续增多的根本方法[8]。因此，在临床选药治疗犬病时，应根据病情结合药敏试验结果合理选药。根据本次细菌分离及药敏试验结果在临床治疗常德地区大肠埃希菌和沙门氏杆菌引起的犬腹泻病时，可首选妥布霉素药、复方新诺明、卡那霉素、萘啶酸、庆大霉素、新霉素、红霉素等对细菌敏感性高的药物，以提高疗效，降低细菌对抗生素耐药性的产生。

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[5]陆承平. 兽医微生物学[M]. 北京：中国农业出版社，2001：223-225，215-216.

[6]倪语星. 细菌耐药性监测与抗感染治疗[M]. 北京：人民军医出版社，2002.

[7]M100-S14抗微生物药物敏感性试验执行标准：第14版信息增刊[S]. 华盛顿：美国临床和实验室标准协会，2004.

[8]朱忠珂，范国英，钟华. 犬大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验[J]. 黑龙江畜牧兽医，2012，8（16）：93-94.endprint