红芽大戟组织培养条件的优化

李林轩等

摘要：优化红芽大戟组织培养快速繁殖技术，为保护红芽大戟的野生资源提供技术支撑。分别以MS和1/2MS为基本培养基，采用正交设计对影响红芽大戟组织培养的继代增殖和诱导生根进行了优化。结果表明，MS+1.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IAA+0.2 mg/L NAA+0.3 g/L 活性炭有利于丛生芽继代增殖；1/2MS+0.75 mg/L IBA+0.2 mg/L PP333适于诱导生根获得再生植株；生根苗移栽于泥炭+珍珠岩（体积比1 ∶1）的混合基质上，成活率达92%。

关键词：红芽大戟；组织培养；继代增殖；正交设计

中图分类号： Q943.1 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）04-0060-03

收稿日期：2013-08-13

基金项目：广西科学研究与技术开发计划（编号：桂科重1355001-5-12）；广西南宁市科学技术开发计划（编号：201002049C）。

作者简介：李林轩（1986—），男，广西桂林人，助理研究员，从事中药资源保护与开发利用研究。E-mail：starry1125@sina.com。

通信作者：韦坤华，博士，助理研究员，从事药用植物生物技术研究。E-mail：divinekh@163.com。红大戟（Knoxia valerianoides Thorel et Pitard）为茜草科多年生草本植物红芽大戟的干燥块茎。主产于广西、广东，云南、福建、海南亦有少量分布，生长在低山坡草丛中的半阴、半阳处。红大戟苦、寒、有小毒，归肺、脾、肾经，药用功能为泻水逐饮，攻毒消肿散结，主治胸腹积水、两便不利、痈肿疮毒、瘰疬痰核[1]，还具有抗菌作用，为中成药紫金锭的主药[2]。由于红大戟使用量的增加、药材使用与种植模式的改变，红芽大戟长期处于野生状态，人为乱采滥挖，红芽大戟野生资源急剧减少，在某些区域几乎已经绝迹。红芽大戟自然繁殖主要通过种子，但由于种胚发育不良，自然散落种子发芽率不到1%。采用常规方法贮藏1年以上的种子，基本丧失活力，几乎不能出苗[3-4]，很难满足市场需求。为更好开发利用红芽大戟资源，扩大药源，本试验通过正交试验优化红芽大戟组织培养条件，为红芽大戟快速繁殖工厂化生产育苗提供技术支撑。

1材料与方法

1.1无菌材料

材料采集自广西药用植物园科研基地内引种栽培生长健壮的、无病虫害的植株，剪取嫩芽作为试验材料。将嫩芽置洗洁精水中浸泡10 min，用自来水流水冲洗15 min，在超净工作台上置于0.1%HgCl2溶液浸泡消毒8 min，再用无菌水浸洗4次，每次浸洗5 min，然后将带有嫩芽的外植体接种于添加 6-苄基腺嘌呤（6-BA）2.0 mg/L+萘乙酸（NAA）0.4 mg/L的MS培养基上[5]。在室内自然散射光照下培养获得无菌丛生芽。

1.2丛生芽快繁培养基优化

将红芽大戟试管苗在MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.4 mg/L 培养基中继代5次后，产生的丛生芽出现枯叶、玻璃化等现象。在对繁殖培养基进行初步筛选的基础上，在 MS+0.3 g/L 活性炭为培养基的基础上以6-BA（1.0、1.5、2.0 mg/L）、NAA （0.1、0.2、0.4 mg/L）、IAA（0.1、0.2、0.4 mg/L）3种激素的3个水平进行正交试验，对红芽大戟的繁殖培养基进行优化，每个处理10瓶，每瓶3个单芽，30 d后以测试管苗生长情况和芽增殖倍数[芽增殖倍数=（30 d后芽数-接种时芽数）/接种时芽数]为主要考察指标来优化繁殖培养基。

1.3生根培养基筛选

为了筛选最佳的生根培养基，在1/2MS为培养基的基础上以IBA（0.5、0.75、1.0 mg/L）、PP333（0.1、0.2、0.4 mg/L）和活性炭（0、0.5、1.0 g/L）3种因素的3个水平进行正交试验，对红芽大戟的生根培养基进行优化，每个处理10瓶，每瓶20个单芽，30 d后统计生根率及平均生根数：生根率=生根芽数/接种总数×100%；平均生根数=总生根数/接种总数×100%。

2结果与分析

2.1丛生芽快繁培养基优化

2.2丛生芽诱导生根

将生长健壮的芽苗单切接入红芽大戟生根培养基中，30 d 后统计生根率及平均生根数。为了筛选最佳生根培养基，使用IBA、PP333和活性炭3个水平设计正交试验，结果（表3、表4）表明，IBA的浓度对试管苗的生根率有显著的影响，但PP333和活性炭对红芽大戟生根率影响不大。对平均生根数分析表明，IBA和PP333对试管苗的平均生根数均有显著影响，PP333影响要大于IBA，而活性炭影响不显著（表3、表5）。进一步分析，生根率和平均生根数主要受IBA浓度的影响，在0.5～0.75 mg/L浓度范围内，随着IBA浓度的增大生根率和平均生根数上升，当IBA浓度高于0.75mg/L时，生根率和平均生根数都下降，表明IBA浓度过高不利红芽大戟丛生芽生根。添加低浓度的多效唑有利于丛生芽生长控制和生根，当IBA浓度不变、PP333浓度为0.1～0.2 mg/L时，生根率和平均生根数随着浓度的增大而升高，当浓度升高至0.4 mg/L时，生根率和平均生根数有所下降，高浓度的PP333抑制丛生芽的生根，最佳的生根培养基为1/2MS+0.75 mg/L IBA+0.2 mg/L PP333，在此培养基上的生根率达到100%，平均生根数为6.7条（图2）。

2.3再生苗的移栽

根据红芽大戟的生长特性，将已生根的试管苗开盖炼苗2～3 d，洗净根部培养基，移栽于消过毒的泥炭+珍珠岩（体积比 1 ∶1）的混合基质上，置于透光度为75%育苗棚中，每天喷洒少量的水，30 d后移栽成活率达92%。表4红芽大戟生根培养基生根率方差分析

方差来源离均差平方和自由度方差F值P值备注IBA542.892271.4456.810.01≤P<0.05显著PP333157.56278.7816.490.05≤P<0.1不显著活性炭2.8921.440.30P≥0.1不显著误差9.5624.78注同表2。

3讨论

培养基中激素的种类与浓度对植物的繁殖与生根非常关键[7-9]。6-BA是重要的植物激素，可以促进细胞分裂、侧芽生长等[10]。 IAA是植物自身能够形成的内源生长素，能促进细胞分裂与细胞生长，在植物的生长与发育上起着关键作用，通过调节或影响植物整体或细胞水平的多种反应发挥作用[11]。NAA是广谱型植物生长调节剂，具有促进细胞分裂与扩大、诱导形成不定根等作用，但是在组织培养过程中也容易致使材料老化和形成愈伤组织。本研究中我们使用 6-BA、NAA和IAA进行繁殖筛选，IBA、PP333和活性炭进行生根筛选，结果发现如果细胞分裂素的浓度超过 2.0 mg/L，芽的增殖会出现异常，如玻璃化、老化等；如NAA浓度高于 0.2 mg/L 时，愈伤较多，影响增殖倍数。最终确定最佳的增殖培养基为MS+1.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IAA+0.2 mg/L NAA+0.3 g/L，与凌征柱等研究使用的诱导培养基MS+6-BA 3.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L[12]和MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.4 mg/L[13]稍有不同，外源激素总浓度相对较低，这有利于降低材料继代变异可能性。

IBA是植物自身能够形成的内源生长素，是植物主根生长促进剂，能提高发芽率、成活率，并能促进细胞分裂与细胞生长，诱导形成不定根。在植物组织培养过程中，内源激素形成速度缓慢，无法满足植物生长的需求，需要从培养基中吸收。相关研究指出，PP333能促进植物的根系生长和次生根的发生。本试验中选苗是生根的关键因素，主要标准是苗的健壮程度，细弱苗生根移栽后很难成活。红芽大戟生根时选择健壮组培苗进行生根培养，同时加入低浓度PP333促进次生根的发生，同时不易让生根苗生长过高，试管苗纤细、过高移栽后都不易成活。在生根过程中IBA和PP333有协同促进效果，0.75 mg/L 的IBA与0.2 mg/L PP333联合使用生根效果最为理想，红芽大戟苗茎秆粗壮、根数多、根系发育良好，移栽后成活率较高。

参考文献：

[1]国家药典委员会. 中华人民共和国药典[M]. 北京：化学工业出版社，2009：140-141.

[2]广东中药志编委会. 广东中药志：第1卷[M]. 广州：广东科学技术出版社，1994：220-222.

[3]何茂金，胡廷松，黄健君，等. 红大戟的生态环境及生物学特性的观察[J]. 中国野生植物资源，1994（2）：12-14.

[4]陈芳清，徐祥浩. 药用植物红芽大戟的个体生态学研究[J]. 武汉植物学研究，1995，13（2）：147-151.

[5]卫锡锦. 红大戟的栽培技术[J]. 中药材，1997，20（12）：598.

[6]韦莹，余丽莹，黄浩，等. 红芽大戟愈伤组织诱导及分化研究[J]. 广西植物，2009，29（6）：817-821.

[7]韦荣昌，李林轩，吴庆华，等. 植物激素对凉粉草扦插生根的影响[J]. 江苏农业科学，2013，41（8）：239-240.

[8]王菲彬，王斐，管玲玲，等，植物激素对东方百合试管苗鳞片分化不定芽的影响[J]. 江苏农业科学，2013，41（6）：53-55.

[9]陈豫，胡伟，何磊. 不同浓度激素对胡萝愈伤组织诱导的影响[J]. 江苏农业科学，2013，41（2）：54-56.

[10]Polanco M C，Peláez M I，Ruiz M L. Factors affecting callus and shoot formation from in vitro cultures of Lens culinaris Medik[J]. Plant Cell，Tissue and Organ Culture，1988，15（2）：175-182.

[11]Hagen G，Guilfoyle T. Auxin-responsive gene expression：genes，promoters and regulatory factors[J]. Plant Molecular Biology，2002，49（3/4）：373-385.

[12]凌征柱，覃文流，余丽莹，等. 红大戟的组织培养及植株再生[J]. 中草药，2005，36（10）：1555-1557.

[13]黄浩. 药用植物红芽大戟组织培养的研究[D]. 南宁：广西大学，2006.

方差来源离均差平方和自由度方差F值P值备注IBA542.892271.4456.810.01≤P<0.05显著PP333157.56278.7816.490.05≤P<0.1不显著活性炭2.8921.440.30P≥0.1不显著误差9.5624.78注同表2。

3讨论

培养基中激素的种类与浓度对植物的繁殖与生根非常关键[7-9]。6-BA是重要的植物激素，可以促进细胞分裂、侧芽生长等[10]。 IAA是植物自身能够形成的内源生长素，能促进细胞分裂与细胞生长，在植物的生长与发育上起着关键作用，通过调节或影响植物整体或细胞水平的多种反应发挥作用[11]。NAA是广谱型植物生长调节剂，具有促进细胞分裂与扩大、诱导形成不定根等作用，但是在组织培养过程中也容易致使材料老化和形成愈伤组织。本研究中我们使用 6-BA、NAA和IAA进行繁殖筛选，IBA、PP333和活性炭进行生根筛选，结果发现如果细胞分裂素的浓度超过 2.0 mg/L，芽的增殖会出现异常，如玻璃化、老化等；如NAA浓度高于 0.2 mg/L 时，愈伤较多，影响增殖倍数。最终确定最佳的增殖培养基为MS+1.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IAA+0.2 mg/L NAA+0.3 g/L，与凌征柱等研究使用的诱导培养基MS+6-BA 3.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L[12]和MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.4 mg/L[13]稍有不同，外源激素总浓度相对较低，这有利于降低材料继代变异可能性。

IBA是植物自身能够形成的内源生长素，是植物主根生长促进剂，能提高发芽率、成活率，并能促进细胞分裂与细胞生长，诱导形成不定根。在植物组织培养过程中，内源激素形成速度缓慢，无法满足植物生长的需求，需要从培养基中吸收。相关研究指出，PP333能促进植物的根系生长和次生根的发生。本试验中选苗是生根的关键因素，主要标准是苗的健壮程度，细弱苗生根移栽后很难成活。红芽大戟生根时选择健壮组培苗进行生根培养，同时加入低浓度PP333促进次生根的发生，同时不易让生根苗生长过高，试管苗纤细、过高移栽后都不易成活。在生根过程中IBA和PP333有协同促进效果，0.75 mg/L 的IBA与0.2 mg/L PP333联合使用生根效果最为理想，红芽大戟苗茎秆粗壮、根数多、根系发育良好，移栽后成活率较高。

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[9]陈豫，胡伟，何磊. 不同浓度激素对胡萝愈伤组织诱导的影响[J]. 江苏农业科学，2013，41（2）：54-56.

[10]Polanco M C，Peláez M I，Ruiz M L. Factors affecting callus and shoot formation from in vitro cultures of Lens culinaris Medik[J]. Plant Cell，Tissue and Organ Culture，1988，15（2）：175-182.

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[12]凌征柱，覃文流，余丽莹，等. 红大戟的组织培养及植株再生[J]. 中草药，2005，36（10）：1555-1557.

[13]黄浩. 药用植物红芽大戟组织培养的研究[D]. 南宁：广西大学，2006.

方差来源离均差平方和自由度方差F值P值备注IBA542.892271.4456.810.01≤P<0.05显著PP333157.56278.7816.490.05≤P<0.1不显著活性炭2.8921.440.30P≥0.1不显著误差9.5624.78注同表2。

3讨论

培养基中激素的种类与浓度对植物的繁殖与生根非常关键[7-9]。6-BA是重要的植物激素，可以促进细胞分裂、侧芽生长等[10]。 IAA是植物自身能够形成的内源生长素，能促进细胞分裂与细胞生长，在植物的生长与发育上起着关键作用，通过调节或影响植物整体或细胞水平的多种反应发挥作用[11]。NAA是广谱型植物生长调节剂，具有促进细胞分裂与扩大、诱导形成不定根等作用，但是在组织培养过程中也容易致使材料老化和形成愈伤组织。本研究中我们使用 6-BA、NAA和IAA进行繁殖筛选，IBA、PP333和活性炭进行生根筛选，结果发现如果细胞分裂素的浓度超过 2.0 mg/L，芽的增殖会出现异常，如玻璃化、老化等；如NAA浓度高于 0.2 mg/L 时，愈伤较多，影响增殖倍数。最终确定最佳的增殖培养基为MS+1.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IAA+0.2 mg/L NAA+0.3 g/L，与凌征柱等研究使用的诱导培养基MS+6-BA 3.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L[12]和MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.4 mg/L[13]稍有不同，外源激素总浓度相对较低，这有利于降低材料继代变异可能性。

IBA是植物自身能够形成的内源生长素，是植物主根生长促进剂，能提高发芽率、成活率，并能促进细胞分裂与细胞生长，诱导形成不定根。在植物组织培养过程中，内源激素形成速度缓慢，无法满足植物生长的需求，需要从培养基中吸收。相关研究指出，PP333能促进植物的根系生长和次生根的发生。本试验中选苗是生根的关键因素，主要标准是苗的健壮程度，细弱苗生根移栽后很难成活。红芽大戟生根时选择健壮组培苗进行生根培养，同时加入低浓度PP333促进次生根的发生，同时不易让生根苗生长过高，试管苗纤细、过高移栽后都不易成活。在生根过程中IBA和PP333有协同促进效果，0.75 mg/L 的IBA与0.2 mg/L PP333联合使用生根效果最为理想，红芽大戟苗茎秆粗壮、根数多、根系发育良好，移栽后成活率较高。

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[9]陈豫，胡伟，何磊. 不同浓度激素对胡萝愈伤组织诱导的影响[J]. 江苏农业科学，2013，41（2）：54-56.

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