家禽精液保存技术研究进展

李 闯，黄 璇,蒋桂韬，孙 鏖，戴求仲,※，龚炎长，彭秀丽

（1.湖南省畜牧兽医研究所，湖南长沙410131；2.华中农业大学动物科技学院，湖北武汉430070）

家禽的人工授精技术在我国推广应用始于上个世纪80年代，随着人工授精技术的发展和完善，很好的解决了养殖过程中自然交配造成的受精率低、种蛋污染严重、孵化率低等问题。目前在养鸡、养鸭生产中已经得到普遍应用，养鹅生产中人工授精技术也在逐渐成熟。精液保存技术是家禽人工授精技术过程中最主要的环节，精液保存主要包括短期保存和长期保存（冷冻保存）。精液的体外保存时间对优良种鸭精液的使用时间和范围有重要影响，冷冻保存的精液还对种质资源的长期保存有重要意义。

1 家禽精液的短期保存

1.1 家禽精液稀释液的研究

半个多世纪以来，禽类精液稀释液的研究取得了较大的突破。Lake[1,2]分析鸡精液成分发现其由不同种化学物质组成，其中谷氨酸是禽类精浆中最主要的阴离子组份，并首次配制了一种含有与公鸡输精管内液体相同特性的化学成分的稀释液（称为Lake氏液），在精液保存24小时和48小时后，受精率分别达到64%和47%；为此提出使用与公鸡输精管内液体渗透压（－0.6℃冰点压）相似并含有钾、钠、镁和谷氨酸盐的稀释液，能增加精子的存活时间。国内学者张兆旺[3,4]、姚希芳[5]等通过试验也证实了谷氨酸钠对精子有保护作用。张兆旺[6]通过试验证明，柠檬酸的钠盐和钾盐也有延长精子体外保存寿命的功效。杨保田[7]通过研究发现柠檬酸钠溶液能有效的提高鸡精子的生存指数。能源物质是精子在体外存活不可缺少的部分，果糖对于提高贮存精液的受精力具有重要作用。苏东顿[8]的研究结果也证明了果糖能提高精液的受精力。黄仁术[9,10]也通过试验证明果糖的保存效果优于葡糖糖和蔗糖。

稀释液的pH值能影响精子的代谢率和活性，所以其应接近家禽精液的pH值。张兆旺[3]和刘宗政[11]认为鸡精液稀释液pH值在6.8～7.2之间效果最佳。姚希芳[6]在研究稀释液pH值及渗透压对鸡精液保存效果的影响中指出鸡精液稀释液pH值在6.7～7.2之间对精子的生存最为适宜。李辉[12]认为鸡精子在pH值为5.97～8.33的稀释液中能保持较高受精能力，受精率最高达到94.2%。

当精子处于低渗环境，精子细胞得到水分将膨胀，同时精子的畸形率特别是颈部弯曲将大大增加；当精子处于高渗环境，精子细胞失去水分将萎缩。张兆旺[4,7,13]通过试验表明鸡精液稀释液渗透压应为等渗或接近等渗。禽类精子在渗透压范围250～460mOsM/kg·H2O的情况下能保持精子的活力。姚希芳[6]指出鸡精子生存适宜的渗透压是278～434mOsM/kg·H2O。杨保田[7]通过试验也证实精液稀释液渗透压为等渗时精子活动时间最长。赵建军[14]在研究渗透压对鸡精液低温保存的影响中指出渗透压为300mOsM/kg·H2O时精子存活时间、精子生存指数都优于400mOsM/kg·H2O、500mOsM/kg·H2O。

1.2 稀释比例和保存温度的研究

采集到的家禽精液在输精前对其进行适当的稀释能提高精子的存活时间和能力，但如果稀释倍数过高，会造成精子的受精力降低。因此，在稀释精液时应选择出最佳的稀释倍数进行稀释。胡松庭[15]等用鸡原精液和不同的稀释比例（1∶1、1∶2、1∶3）稀释精液，试验证明用鸡原精液、1∶1和1∶2稀释比例稀释精液输精后，得到的种蛋受精率差异不显著（P>0.05）。朱庆[16]用1%NaCl液作为稀释液，用鸡原精液与1∶1和1∶2稀释比例稀释组进行受精率对比试验，试验结果表明鸡原精液与1∶1稀释组的受精率无显著差异，但其受精率低于1∶2稀释组。彭秀丽[17]认为鸡精液1∶1稀释时种蛋受精率较高。潘越博[18]研究鸡精液稀释比例对种蛋授精率的影响，试验表明稀释比例1∶1、1∶1.5、1∶2的受精率显著高于原精液。林如龙[19]（2014）认为在半番鸭生产中按1∶1比例稀释精液可以获得较高的种蛋受精率。

精液短期保存根据温度不同可分为常温保存和低温保存。常温保存一般应用在人工授精过程中精液采集后立即输精的过程，时间比较短暂，一般为0.5h，而低温保存的保存时间一般超过24h。胡善虎[20]通过试验证明鸡精液在30～35℃之间保存并在半个小时内输精效果最为适宜。孙占田[21]采精后把精液分别保存在35℃、37℃、39℃温度下半小时内完成输精，发现保存温度39℃的受精率最佳。景栋林等[22]通过用不同稀释液稀释鸭精液，在2～5℃、8～10℃和25℃下保存24h后观察精子活力发现，鸭精液液态保存的最适宜度为2～5℃。许月英等[23]用0.9%NaCl和牛奶2倍量稀释鹅精液，分别在2～5℃、15～25℃、38～39℃和48.5℃温度下保存，发现牛奶稀释的鹅精液在2～5℃低温条件下保存效果最好。

2 家禽精液的冷冻保存技术的研究

2.1 家禽精液冷冻保存技术的现状

禽类精液的冷冻保存研究开始的比较早，早在20世纪40年代国外科学家用在－0.6℃条件下冷冻鸡精液30秒后的解冻精液输精，得到冻精条件下的第一只小鸡[24]。在随后的几十年，大量的研究证明这一技术在生产实际中具有极为重要的意义。Polge[25]第一个用甘油作为冷冻保护剂对鸡精液进行冷冻，解冻后的精子仍存在活力。在第2年的试验中他首次用解冻后精液输精并取得成功，但受精率很低。之后许多人都加入到对家禽精液冷冻技术的研究中，使冷冻技术得到了很大的发展。随着人们的研究，研究的方向也有了很大的扩展，这些研究不光涉及到精液冷冻后精子形态的变化和精子结构的变化，还涉及到冷冻保护剂的选择、最佳平衡时间的确定、解冻温度的选择等，多方面的研究也使冻精输精的受精率大大提高。Lake[26]用鸡的精液冷冻后输精得到的受精率达到90%，但鸭的冷冻精液只得到30%的受精率，鹅的冷冻精液每天输精受精率为78.5%，而火鸡的冷冻精液受精率则极低。俄国科学家K.Tselutin[27]用冷冻保存技术保存鸡、火鸡、鸭和鹅的精液，解冻精液输精受精率为鸡75%～85%，火鸡80%～90%，鸭69%～90%，鹅81%～90%。

2.2 精液冷冻保护剂和冷冻方法的研究

Polge[25]一次偶然机会在对鸡精液进行稀释时加入了10%～15%甘油，用干冰在－79℃下冷冻精液，最后发现精子的活性可维持10周，稀释液中加入甘油的出现彻底变革了精子冷冻保存原有的技术程序。甘油的出现使人们对家禽精液冷冻保护剂的研究逐渐增多，随着研究的发展冷冻保护剂种类在逐渐增多，主要包括甘油、二甲基亚砜、乙烯乙二醇、二甲基甲酰胺（DMF）和丙基乙二醇等，这些冷冻保护剂中前四种已被国外许多的研究者所采用如表1[28]。Lake[29]用甘油作防冻剂对冷冻保存方法进行改进，对在－196℃液氮中保存2年半的鸡精液进行解冻输精，其受精率仍能达到80%。王红军[30]用DMA和EG按一定比例混合作为冷冻保护剂冷冻鸡精液，取得了不错的效果，精子畸形率明显降低。黄素红[31]指出用DMSO和DMA作为冷冻保护剂冷冻鸡精液，对精子的保护效果最佳。任静波[32]以DMA作为冷冻剂，冷冻保存鹅精液，解冻后精子活力为41%，受精率达到78.1%。王世银[33]用浓度为6%的甘油作为冷冻保存剂时，对冷冻过程中鸡精子的保护效果最好，冻后活力达到0.68，精子复苏率达到97.5%。

一般来说，精液在平衡前先降温到2～5℃，在此温度下平衡一段时间后再进行冷冻。冷冻的方法可以参考表2[28]，对这些方法的输精效果的比较研究目前还没见报道。

2.3 平衡时间和解冻温度的研究

精液在冷冻之前需要平衡一段时间后再进行冷冻，平衡的主要作用是让冷冻保护剂能充分渗入精子内部，使其渗透的活性物质达到平衡，能在精液冷冻过程中起到保护作用。冷冻精液需要解冻之后复苏精子活力后进行输精，有学者把对精液的解冻方法分为高温、温水和低温解冻三种，就目前研究的情况来看用温水解冻对精液的保存效果最好。徐日福[34]通过试验研究不同平衡时间和解冻温度对鸡精液冷冻保存效果的影响发现，认为最佳的平衡时间为30min，同时发现试验发现鸡冷冻精液在30℃、37℃和40℃解冻时的精子活力最高，所以得出对鸡冷冻精液解冻时最佳解冻温度是30～40℃。韩雪峰[35]用不同的冷冻保护剂对鸭精液进行冷冻，分别用不同的平衡时间解冻温度处理鸭精液，实验结果表明平衡时间为15min时冷冻精液的效果最佳，解冻温度在40℃时，解冻后的精子活力都高于其他解冻温度组。

3 小结

关于家禽精液的保存，由于鸡、鸭、鹅等品种不同，其精液的许多生理学特性不同，精液在体外保存及维持活力需要的条件也不同。零度以上保存精液需要添加适当的稀释液加以稀释，保存温度以0～5℃最为适宜；禽类冷冻精液在实验阶段受精率较高，但应用于实践还有一些问题需要解决，如冷冻保护剂的选择，通常我们选用的防冻剂都是甘油，这样冷冻保存后能得到很高的精子活力，但甘油有毒性，用含有甘油的精液输精后精子将丧失受精能力。冷冻程序各步所采取的措施也能影响受精率，冷冻程序各步间的联系和相互作用对精子活力和受精率可能有影响，不同种类的公禽和同种公禽的不同个体之间，其精子的抗冻力可能也有遗传差异。总之，禽类精液的保存还需要进一步的研究和发展，使其更好的应用于实践生产当中。

（11～35 略，需要者可向作者索取）

[1]Lake P E, Mcindoe W M. The glutamic acid and creatine content of cock seminal plasma[Journal Article]. Biochem J. 1959, 71(2): 303-306.

[2]Lake P E. Studies on the dilution and storage of fowl semen[Journal Article].J Reprod Fertil.1960,（1）:30-35.

[3]张兆旺,张进邦. 鸡精液稀释液筛选试验[J]. 甘肃农业大学学报,1992,（4）:333-338.

[4]张兆旺,姚希芳. 影响鸡精液3℃下保存效果的因素[J].中国家禽,2002,（13）:26.

[5]姚希芳. 稀释液pH 值及渗透压对3～5℃下鸡精液保存效果的影响[J]. 甘肃畜牧兽医,2002,（5）:5-7.

[6]张兆旺. 稀释液溶质和渗透压对鸡精子体外存活及形态的影响[J]. 中国家禽,2001,（8）:50-52.

[7]杨保田,牛盛模. 稀释液溶质及渗透压对鸡精液低温保存效果的影响[J]. 甘肃畜牧兽医,2006,（6）:21-22.

[8]苏东顿,丁余荣,王桂朝,刘国荣. 提高肉用种鸡人工授精效果的研究Ⅴ——肉用种鸡精液稀释液的筛选[J]. 中国家禽,1993,（4）:20-21.

[9]黄仁术. 常温下基于Lakes 液的皖西白鹅精液稀释液研究[J]. 湖南农业科学,2009,（1）:125-126+130.

[10]黄仁术. 低温下基于Lakes 液的皖西白鹅精液稀释液研究[J]. 畜牧与兽医,2009,（3）:62-64.