不同类型表面活性剂与蛋白质作用研究进展

曹洪玉，张莹莹，唐 乾，郑学仿

（1. 大连大学 生命科学与技术学院，辽宁 大连 116622；2. 辽宁省生物有机化学重点实验室，辽宁 大连 116622）

在化学工业、生物和医药等许多领域越来越注重蛋白质与表面活性剂（Protein-Surfactant，P-S）的相互作用的特性。蛋白质在表面活性剂溶液中可保持活性[1,2]，二者混合体系在食品、化妆品和药物配方[3]等领域中具有广泛而重要的应用：表面活性剂可改变一些蛋白质的热稳定性[3,4]和热变性，据此可以优化含有蛋白质的产品；表面活性剂被广泛应用于蛋白提取和纯化[5,6]，如测定的蛋白质分子量的方法中使用十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳；蛋白质自组装和稳定性研究中最有效的方法是使蛋白质变性和复性，表面活性剂则是理想的变性剂[7]；表面活性剂可作为探针分子，利用光谱法可研究蛋白质结构、功能及二者相互作用情况。基于以上应用，P-S 相互作用的研究成为人们越来越重视的课题.

蛋白质是一类具有特殊结构的两性聚电解质，明显不同于其它类型的聚电解质，P-S 相互作用和蛋白与大分子拥挤试剂[8,9]、多糖类大分子[10]等聚合物相互作用相比，具有许多独特之处，且更为复杂.目前研究P-S 相互作用的方法有紫外、荧光、表面张力测定技术、在线停流技术、小角中子散射、电导率、光散射、核磁共振（NMR）等。其中荧光及紫外等光谱法可以研究P-S 混合体系的微环境和微粘度，测量胶束的聚集数及尺寸大小；在线停流-荧光光谱可以用于检测P-S 相互作用的折叠过程及动力学机理。我们课题组利用光谱法在蛋白质和小分子相互作用方面开展了一些工作[11,12]，采用在线停流联用光谱法等手段研究过蛋P-S 的相互作用[13]。本文结合课题组的工作，综述了P-S 相互作用所形成的复合物的结构化学性质及蛋白质分别与不同类型表面活性剂相互作用特征。

1 蛋白质-表面活性剂复合物结构及吸附机理

P-S 复合物的结构是了解它们之间相互作用的基础，目前认为二者复合物的结构有三种结构模型[14]：(a)项链模型、(b)棒状模型、(c)柔软的螺旋状模型（如图1）。自由边界电泳实验提出了“项链模型”，在此模型中，成胶束状态表面活性剂首先诱导蛋白质发生去折叠过程，不断聚集到蛋白质分子上；“棒状模型”是根据粘度实验所提出的，P-S 复合物呈坚硬棒状结构，实验测定该结构有一定的回旋半径，短轴基本是常数，并发现棒的长度与蛋白质分子量成正比；“柔软的螺旋模型”是理论结合模型，蛋白质的疏水区域缠绕在由表面活性剂分子形成的柔软圆柱状胶束的表面。

Nilsson[15]曾经总结并绘出了典型的P-S 曲线，平均每个蛋白质分子上结合的表面活性剂的数目与游离表面活性剂浓度的对数呈函数关系。随着表面活性剂浓度的增大出现四个不同区域：(I)特异性结合(a)；(II)非协同性结合(b)；(III)协同性结合(c)；(IV)饱和结合(d)。特异性结合主要是电性作用，即表面活性剂的极性基结合在蛋白质表面的反电性基团上。特异性结合作用与表面活性剂的非极性碳氢链长成正比。表面活性剂达到一定浓度后将诱导蛋白质的分子链伸展，会发生协同性结合，且结合量急剧增加，表面活性剂以分子聚集体形式结合到蛋白质上，在这一阶段也易发生蛋白质变性。达到饱和结合后，继续增大表面活性剂浓度，形成胶团的表面活性剂与P-S 复合物共存在溶液中。

图1 蛋白质-表面活性剂（P-S）复合物结构示意图

P-S 相互作用能显著改变两种分子界面间吸附层的性质，影响乳状液和泡沫等分散体系的稳定性，研究方法主要有Langmuir-Blodgett(LB)膜技术，扫描电子显微镜，原子力显微镜等[16]。Dickinsion[17,18]曾经提出了P-S 混合体系界面吸附有两种机理：增溶机理和置换机理。增溶机理是指分散在表面的蛋白质与水溶性表面活性剂形成P-S 复合物，蛋白质分子以复合物形式进入水相，并发生强烈的相互作用，一般蛋白质与离子型表面活性剂混合体系属于此机理。置换机理是指由于表面相面上分散的蛋白质被表面活性剂置换下来，此时表面活性剂强烈地吸附于表面。非离子型表面活性剂亲水性较差，蛋白质与其主要发生疏水相互作用，使蛋白质亲水性增加，活性降低，随着蛋白质分子复合结构的体积增大，其界面膜的紧密性下降、强度降低，溶液中表面活性剂浓度增大一定数值时，可将复合物置换下来，最终使界面主要由表面活性剂所组成，故这一体系属于置换机理。

2 不同类型表面活性剂与蛋白质相互作用

蛋白质包含非极性、极性和带电基团，许多两亲分子均可蛋白质发生各种作用。表面活性剂疏水部分通常由烃基构成，亲水部分称为头基。跟据表面活性剂极性基团的解离性质分类可分为阳离子型、阴离子型、两性离子型以及非离子型表面活性剂。表面活性剂在不同条件下可形成具有不同结构的分子有序组合体，如胶束、反胶束等，其分别与蛋白质相互作用也不同。P-S 之间主要存在着静电作用和疏水作用，离子型表面活性剂与蛋白质作用主要是极性基的静电作用和疏水碳氢链的疏水作用，分别结合到蛋白质的极性和疏水部分，形成P-S 的复合物。而非离子型表面活性剂主要通过疏水力与蛋白质发生作用，其疏水链与蛋白质的疏水基团之间的相互作用对表面活性剂和蛋白质的结构和功能都能产生一定的影响。因此，表面活性剂的类型、浓度和体系环境决定了表面活性剂是使蛋白质稳定还是失稳，聚集还是分散。

2.1 阴离子型表面活性剂与蛋白质的相互作用

阴离子型表面活性剂（anionic surfactant，AS）与蛋白质的相互作用研究最多，这也因AS 与蛋白质之间有着相对较强的相互作用有关。AS 离子头基团静电作用较强，结合到蛋白质表面带相反电荷的基团上，非极性基团以疏水力结合到蛋白质非极性区域，使蛋白质结构发生变化，从而促进或阻止蛋白质的聚集。P-AS 的相互作用依赖于蛋白质的性质(特别是蛋白质的表面电荷)及AS 浓度、结构等。二者相互作用过程中，静电作用和疏水作用为主要驱动力，静电作用与蛋白质的电性相关，可以表现为静电吸引或静电排斥。

十二烷基硫酸钠(SDS)有普通表面活性剂很好的性能，且化学性质稳定，在酸性或碱性介质中以及加热条件下都不会分解，所以SDS 被广泛应用于蛋白质的分离纯化[5,6]以及蛋白的稳定性和变性研究等。Ghosh 等[19]运用CD 光谱研究改变SDS 的浓度对固定浓度胰蛋白酶的影响，SDS 浓度为2.5 mmol/L 时，胰蛋白酶的螺旋含量比无SDS 时的含量低，加入过量SDS 时形成胰蛋白酶-SDS 聚集体，胰蛋白酶-SDS聚集体间强烈的静电斥力使得蛋白质分子伸展并引起蛋白变性。Deep 等[20]发现[SDS]/[BSA]摩尔比较小时，SDS 可为BSA 的结构稳定剂，摩尔比增大时，SDS 改变BSA 结构，甚至变性。Kelly 等[21]研究更为细致，固定BSA 浓度为0.5%，逐渐增加SDS 的浓度(0~9 mM)，当SDS 浓度为4 mM 时，BSA 完全变性，并得到了SDS 与BSA 结合曲线的四个区域分别对应于结合等温线的四个结合阶段，得出各个阶段热效应及对蛋白质热稳定性的影响。Moriyama 等[22]也证实SDS 在低浓度下对BSA 有保护作用，提出摩尔比[SDS]/[BSA]=15 时保护作用最好，随表面活性剂疏水碳链增长，保护作用越强，但阳离子表面活性剂没有发现这种作用，即这种作用是由AS 的性质所决定的，AS 可同时与蛋白质上正电性和非极性的氨基酸侧链结合达到稳定蛋白质的作用。

P-S 相互作用时会随表面活性剂浓度改变而出现多个过渡态并改变两者之间的相互作用情况和蛋白理化性质。SDS 诱导RNaseA 去折叠过程中[23]蛋白存在3 个过渡态，在初始态和第一个过渡态中，SDS作用在RNaseA 的不同表面活性位点，提高SDS 浓度（低于cmc 值），蛋白陆续呈现第二、三过渡态，二者之间疏水作用占主导，蛋白开始去折叠，部分包埋的蛋白残基暴露在溶液中，继续升高SDS 浓度至5mM 时蛋白光谱不再变化，RNaseA 呈完全去折叠态。Gebicka 等[24]认为SDS 和AOT 可以破坏血红蛋白（Hb）的三级结构，在单体形式下它们均能将高铁Hb 转换成可逆的高铁血红素原，将其过氧化物酶活性降低，动力学数据表明该变化的过程至少分为两步，先是表面活性剂与蛋白形成复合物，然后复合物转化为高铁血色原。十二烷基苯磺酸钠SDBS-BSA 体系的RLS 强度要远大于SDS-BSA 体系的RLS，且该强度与BSA 的浓度成正比，Yang 等据此建立了测定痕量蛋白质的方法[25]。Li 等发现SDBS 可调节溶菌酶的酶活[26]，在低浓度时可诱导使溶菌酶更易溶于水，在高浓度时则诱导改变溶菌酶活性位点内的疏水环境。

2.2 阳离子型表面活性剂与蛋白质的相互作用

阳离子型表面活性剂（cationic surfactant，CS）也是离子型表面活性剂，同AS 一样，其与蛋白质的作用过程中也有疏水作用和静电作用，改变蛋白质的结构，不一样的是，其作用较弱，且CS 与蛋白质相互作用大多属于吸热反应，对蛋白质结构的影响也较小[27]。在医药领域中，软膏剂中CS常用作乳剂基质，主要用于角质层中的角蛋白纤维，增加药物的通透性，很多CS 有很强的杀菌效果，故常用于消毒和灭菌。鉴于以上用途和优点，国内外对于此类研究也逐渐增多，目前主要集中于对蛋白质解折叠的影响，以及结合方式和驱动力方面。

紫外吸收光谱研究阳离子表面活性剂CTAB 对血红蛋白仿过氧化物酶催化活性的影响时，应用稳态速率法测定了米氏常数(Km)、米氏速率(Vm)及反应级数等动力学参数，发现该体系在CTAB 存在时产物的生成速度比无CTAB 时有所提高[28]。Taleshi 等[29]证实溶菌酶在低浓度DTAB 条件下主要驱动力为静电作用，随着DTAB 的增加，酶发生解折叠且露出疏水部位，且不同于其与SDS相互作用中的放热过程，溶菌酶与DTAB 相互作用为吸热过程。比较BSA 和不同链长的CS（C21H38ClN，C19H34ClN，C17H30ClN）作用时，发现随着表面活性剂链长增长，蛋白聚集所需的表面活性剂的量减少，这一实验证实二者相互作用的驱动力有疏水作用[30]。Rafati 等[31]实验证实TTAB 和CTAB 均促使血红蛋白结构改变，血红蛋白的四个亚基间作用力减弱，血红素活性位点的暴露，且二者亲和力随着温度的升高而增加，即该作用过程是吸热过程。我们发现CTAB 和DTAB 在低浓度时对高铁肌红蛋白的血红素中心影响不大[32]，但是对Trp 和Tyr 的微环境影响很大，高浓度时以聚合体形式通过静电作用和疏水作用，主要是静电作用直接作用于血红素中心，使Soret 带发生蓝移，metMb 形成五配位高自旋(5-cHs)复合物，使得血红素逐渐从疏水腔中释放出来, 同时对蛋白质的二级结构影响较大。DTAB 由于自身结构的特点，与CTAB 作用于蛋白的过程有些区别，形成了一个中间态，但最终导致heme的暴露。

2.3 两性表面活性剂与蛋白质的相互作用

两性表面活性剂（zwitterionic surfactant，ZS）的分子结构中同时具有阴离子亲水基团和阳离子亲水基团，属于温和性的离子型表面活性剂，其对蛋白质的作用也不如阴、阳离子型表面活性剂强烈，但因在分子的端部同时存在酸性基和碱性基，在具有普通表面活性剂的性能基础上，还增加许多独特的性质，如：低毒性、对人体的低刺激性、良好的生物降解性、低公害低污染、耐硬水及高浓度电解质性及可吸附在物质界面且不生成憎水薄层等，使其成为人们倍感兴趣的产品。

生物样品不能直接注入色谱柱中，因其中所含的氯离子与其他分析离子峰可能重叠，或由于氧化/还原而改变物质性质，蛋白质也会吸附在固定相上，从而缩短分离柱的使用寿命，而用ZS 作流动相能克服上述缺点。Hu 等[33]将甜菜碱型两性表面活性剂溶解于电解质溶液中，此流动相能快速洗提含生物样品中的蛋白质。在此流动相中ZS 保持固定相中的表面活性剂数量恒定，两性胶束能通过除去蛋白质中的洗涤剂而达到清洗分离柱的效果，增加被分析离子停留时间的稳定性，延长了分离柱的使用寿命。

Moreira 等[34]发现十六烷基磺丙基甜菜碱(HPS)能促进HbGp（一种胞外巨型血红蛋白）的化低聚物分解以及自氧作用从而形成高铁蛋白类型，与四聚体血红蛋白不同的是，在所研究的HPS 浓度范围内，表面活性剂没有导致折叠和自氧化程度降低；HPS与血红蛋白的作用明显低于SDS 和CTAC 对蛋白的作用，这是因为其与蛋白之间的静电引力作用弱。Gelamo 等[35]根据HPS 对BSA 的结合常数变化而发现提高pH 能增强HPS 与BSA 的结合。HPS-BSA 的结合常数小于其与阴离子型表面活性剂SDS 的结合常数，但略大于其与阳离子型表面活性剂CTAC 的结合常数，且HPS 对蛋白结构都有一定的影响。

2.4 非离子型表面活性剂与蛋白质的相互作用

非离子型表面活性剂（non-ionic surfactant，NIS）在溶液中不呈解离状态，稳定性高，相溶性好，毒性和溶血作用小，不易受电解质和溶液的影响，能与大多数药物蛋白配伍，可以增强活性物质的稳定性和溶出率，所以被广泛应用药用制剂。NIS 双水相萃取分离系统在一定温度(浊点)以上，可从水相中分离出包含蛋白质的表面活性剂，少量的表面活性剂和蛋白质留存于水相中，此系统适合分离具有一定疏水特性的水溶性蛋白质，与其他体系相比，在不需要有机溶剂和很低的表面活性剂浓度就会产生相分离，基于以上优点，该类研究意义重大。

与离子型表面活性剂相比，NIS 与蛋白质作用的报道较少，主要原因是NIS 临界胶束浓度(cmc)值较小，在溶液中的单体浓度很难达到与蛋白质发生协同结合的浓度，二者通过疏水力发生相互作用，从而增加蛋白质亲水性，与蛋白质的作用较弱；NIS 的疏水部分结合在蛋白非极性氨基酸上，极性部分则结合肽键和一个或多个极性氨基酸。此领域中研究的比较多的是广泛应用于生物医药领域中的聚山梨醇系列。

聚山梨醇20（Tween20）和聚山梨醇80（Tween80）可应用在生物治疗药物对蛋白降解途径[3]中，二者能够阻止影响生物药剂产品中蛋白质的稳定性因素的产生，如自身氧化导致过氧化氢的形成，侧链分解导致像甲酸一类物质的短链酸类的形成等。Garidel 等[36]也发现Tween20 和Tween80 均能够通过氢键结合HSA 的疏水区域，从而降低蛋白自身之间的相互作用和蛋白聚集，使蛋白的变性温度升高，增强蛋白的稳定性。对于免疫球蛋白类，聚山梨醇能够使胶体蛋白稳定的原因应该不是直接结合到蛋白上，因为测到的结合分子数很少。Wei 等[37]证实Tween80 可以抑制白细胞介素-2 突变体溶液储存时因晃动引起的二硫键或其他化学键形成从而使蛋白聚集，但同时也有负面作用，它可以不同程度地氧化白介素-2 突变体，Tween80 不仅可以增加蛋白的氧化速率，还可以改变白介素-2 氧化的温度依赖性和稳定性。用表面活性剂Brij-35 介导的方法将膜蛋白AgrC 镶嵌到脂质体上，即形成蛋白脂质体[38]，体外磷酸化实验表明AgrC 蛋白在脂质体中的自我磷酸化活性较高，蛋白脂质体的构建不仅解决了膜蛋白的不稳定性问题，也为体外研究AgrC 蛋白的结构、功能和信号转导机制提供了新的思路。

2.5 新型表面活性剂与蛋白质相互作用

新型表面活性剂具有很多优良的性能，在研究其与蛋白的作用情况也有很多优越性，如极易形成胶束且可以控制胶团形状，在酶的分离纯化应用中表现出色；在一定条件下，利用其在有机相中自发形成的胶束，将水溶性蛋白质提取至反向胶束的极性核中，创造条件移至另一水相，实现蛋白质分离提纯的目的，这一方法的优点是酶不直接与有机相接触，因而不易失活。医药中使用的酶制剂存在稳定性低、临床上产生抗原性等问题，利用新型表面活性剂对酶进行修饰可解决以上问题，这对于人工合成基因工程蛋白的复性和药物的传递方面应用很有帮助，目前对于此类研究还处于摸索阶段。

氟表面活性剂中分子中碳氢链的氢原子全部或部分被氟原子取代，所含全氟代烷基兼具疏水性和疏脂性，在水和有机溶剂中均呈现出良好的表面活性，具有很高的热稳定性及化学稳定性，在强酸和强碱中均稳定、不分解，可在不同药液中降低其表面张力，H 被强负电性的F 取代后，与蛋白相互作用加强。氟表面活性剂全氟代辛烷磺酸钾（PFOS）、全氟代丁烷磺酸钾(PFBS)分别与HSA 相互作用，并与氢代表面活性剂比较，发现C-F 键的刚性能使得烷链变硬，疏水性增强，PFOS 对蛋白的作用比相同长度疏水链氢代的表面活性剂作用强[39]。研究发现全氟壬酸铿与溶菌酶混合体系中二者相行为与结构中有相同的碳氢链的AS 与电性相反蛋白质的相行为类似[40]，Sesta等[41]则发现二者有较强的结合作用，并明显改变了溶菌酶的结构。

Gemini 表面活性剂具有优越的表面性能及良好的生物降解性，它是通过化学键将两个及两个以上的相同（或几乎相同的）表面活性剂单体在亲水头基附近用联接基团将两亲成分联接在一起形成的一种新型表面活性剂。在盐中不同的聚集态[42]和偶联表面活性剂特殊的分子结构使其与蛋白质或DNA 等生物分子的作用比其他表面活性剂更强烈[43]。酶和底物被包围在水/Gemini/有机溶剂体系组成的胶团结构内，以模拟酶在活细泡中的功能，调节Gemini 表面活性剂结构可改变微团尺寸，亦可改变酶活性。Dan 等[44]发现Gemini 与蛋白可形成复合物，且主要作用于BSA 的色氨酸残基，对明胶的酪氨酸残基和苯丙氨酸残基都有影响，使蛋白的芳香族氨基酸暴露于更疏水的环境中。由于Gemini 具有双亲水头部和双疏水尾部[45]，Gemini 在低浓度（0.145~1 mM）时便可使蛋白大幅度地解折叠，α-螺旋含量迅速减少，蛋白构象变化和饱和点均比CTAB 所需的浓度低得多。pH、温度以及表面活性剂的立体化学结构均对Gemini 与蛋白的相互作用产生影响[46]，其中立体化学结构影响表面活性剂的表面性质及对BSA 的作用，但不影响在溶液中的胶束性质。

新型镍螯合表面活性剂TX-Ni 是一种配合物表面活性剂，具有较强的疏水基团，在较高温度下可有效的疏水并生成胶束。S.Wang 等[47]研究TX-Ni 在生物分离应用时发现，含多个组氨酸的蛋白EGFP 随TX-Ni 浓度升高极易被萃取至胶束相，而相同条件下只有一个组氨酸的lysozyme 却不受影响，这一新型表面活性剂可以用于蛋白分子组氨酸残基数目不同的混合蛋白体系的分离。还有一些新型表面活性剂，如糖胺类表面活性剂，还有由微生物所产生的生物表面活性剂（如枯草杆菌表面活性素[48]）等有着无毒、良好的生物降解性等优点，作为天然添加剂，在食品工业、精细化工、医药等方面也愈来愈受到人们的青睐。

3 结论与展望

表面活性剂种类、浓度和体系环境的不同决定了其分别对蛋白质的作用及吸附机理也不相同。在各种类型的单一表面活性剂中，研究最多的是阴离子表面活性剂与蛋白质（AS-P）相互作用，这源于AS 与蛋白质之间的结合作用相对较强，CS-P 作用行对较弱，NIS-P 作用则最弱，新型的表面活性剂中含氟表面活性剂及Gemini 与蛋白质作用多样化。目前更多研究者倾向于研究多种类型的表面活性剂对同一种蛋白质作用[49-51]，或不同种类蛋白与同一类表面活性剂相互作用的不同之处、不同的机理及各自作用的特点，以期掌握P-S 作用规律。表面活性剂对蛋白质影响尚属于探索阶段，且未来应用极为广泛，基于以上原因，P-S 相互作用的研究一直非常活跃，不断涌现的新P-S 混合体系研究方法，必将推动蛋白质处理新技术的发展。

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