藏药湿生扁蕾对人结肠癌SW480 细胞凋亡调控因子Bcl-2及Bax 的mRNA 表达的影响△

高 娜 景 明 张艳霞 王雅莉 陈正君

(1.甘肃中医学院定西校区，甘肃 兰州 743000；2.甘肃省中药药理与毒理学重点实验室，甘肃 兰州 730000；3.甘肃中医学院，甘肃 兰州 730000)

结肠癌(colorectal cancer，CRC)是常见的消化道系统恶性肿瘤之一。据统计，全世界每年结肠癌的新增人数高达120 万，死亡患者约60.87 万［1］，严重威胁着人们的生活与健康。而在北美、欧洲各国，结肠癌的死亡率在癌症死亡原因中高居第2 位［2］。随着我国人民生活水平的改善和饮食结构的改变，结肠癌的发病率呈逐年上升趋势［3］。目前，虽然西药在以外科手术为主的综合治疗方面取得了一定的进展，但其5 年生存率仍维持在50%左右［4］，导致临床治疗失败和患者死亡的主要原因是肿瘤的易复发、转移生物学特性及其耐药性［5，6］;其次是治疗结肠癌化疗药物的较大毒副作用。因此，进一步深入探讨结肠癌发病机制，探寻低毒有效的抗肿瘤药物是当前临床研究的热点课题，也是肿瘤防治工作者面临的迫切任务之一。

藏药湿生扁蕾具有清热解毒、健脾止泻的功效，藏医用全草治疗肠炎、痢疾、腹泻等疾病在临床上取得了很好的疗效［7］。近年来，随着对湿生扁蕾有效成分研究的深入，其功效也不断被发现。有研究表明，湿生扁蕾提取物能够抑制动物体内S180 肉瘤及其它瘤株的生长［8］，此药中的1 -羟基-3，7，8 -三甲氧基口 山 酮及1，7 -二羟基-3，8 -二甲氧基口 山 酮对卵巢癌细胞HO -8910 也具有毒性作用［9］。本实验研究藏药湿生扁蕾影响SW480 细胞凋亡的调控因子Bcl -2 及Bax 的mRNA 表达，并探讨其相关机制，为结肠癌的治疗和新药开发开拓思路。

1 仪器与试药

1.1 试验药物: 藏药湿生扁蕾提取物的制备: 取湿生扁蕾药材，粉碎，过四号筛，称取粉末100g，加15 倍量70%乙醇回流提取1.5h，滤取药液，药渣再用12 倍量70%乙醇回流提取1.5h，合并两次药液，滤过，滤液回收乙醇后备用。药渣挥尽乙醇，加12 倍量水煎煮1.5h，滤过，滤液减压浓缩后与醇提浸膏合并，冷冻干燥，即得。

湿生扁蕾提取物供试液的制备: 称取湿生扁蕾提取物50 mg，用0.02%二甲基亚砜溶解，抽滤除菌，-20℃保存备用。需要时(用生理盐水)稀释至工作液。

1.2 细胞株: 人结肠癌SW480 细胞株购自江苏江阴齐氏生物科技有限公司。

1.3 试剂: DMEM 培养基(Hyclone 公司);胎牛血清(FBS，Hyclone 公司);0.25%胰蛋白酶(trypsin，Hyclone 公司);二甲亚砜(DMSO，Gibco 公司);PBS(磷酸盐缓冲液，Hyclone公司);Trizol 试剂盒(Invitrogen 公司);RT 试剂盒和PCR试剂盒(Promega 公司);PCR 引物(上海英俊生物有限公司)。

1.4 仪器: 超净工作台(苏州净化设备公司);二氧化碳培养箱(德国Heraeus 公司);9600 型PCR 仪(美国PE 公司);Gel DOC 2000 型凝胶成像分析系统;5417R 高速冷冻离心机(德国Eppendorf 公司);APC 300 型电泳仪和水平式电泳槽(美国Bio-Rad 公司)。

2 方法与结果

2.1 SW480 细胞的培养: 采用常规培养SW480 细胞，培养液为含有10% 小牛血清及青、链霉素各100u/ml DMEM液，在37℃，饱和湿度，5%CO2 孵箱中培养，细胞单层贴壁生长至80% ～90%融合时，以0.25%胰蛋白酶/EDTA 消化后传代培养，处于对数生长期的细胞用于实验。

2.2 RT-PCR 法检测Bc1 -2 和Bax 的mRNA 表达: 对数生长期的SW480 细胞经胰酶消化后，接种于6 孔培养板中，细胞数量约为2 ×105 个/孔，24 h 后分别以不同浓度(250、500、1000 μg/ml)的湿生扁蕾提取物干预，继续培养24h 后，提取每组总RNA。

2.2.1 细胞总RNA 的提取: 按照Trizol 试剂盒说明方法进行，随后取2μgRNA 按照逆转录反应试剂盒要求配制反应体系进行反转录，反转录后产物置于-20℃保存，用于PCR 扩增。

2.2.2 目的基因PCR 扩增: 在NCBI 上查目的基因全序列，利用Premier5.0 软件设计引物序列。Bcl -2: F: 5' -CAG CTG CAC CTG ACG CCC TT - 3'，R: 5' - GCC TCC GTT ATC CTG GAT CC-3';Bax: F: 5' -TGC TTC AGG GTT TCA TCC AGG-3'，R: 5' -TGG CAA AGT AGA AAA GGG CGA-3';GAPDH: F: 5' - CG ACC ACT TTG TCA AGC TCA-3'，R: 5' - AG GGG TCT ACA TGG CAA CTG-3';β-actin: F: 5`-GGA GAT TAC TGC CCT GGC TCCTA-3`，R: 5`-GAC TCA TCG TAC TCC TGC TTG CTG-3`。取cDNA 1.0?l，加10 × Taq Buffer2. 0?l，25 mM Mg2 + 1. 2?l，10 mM dNTP0.4?l，上下游引物各0.4?l，1U/mlTaq 酶0.6?l，DEPC 水14.0?l 配成20?l 的总反应体积。在95℃预变性3min，94℃40s，55℃40s，72℃45s，35 个循环，72℃10min。扩增产物4℃保存，用于琼脂糖凝胶电泳。

2.2.3 PCR 产物表达: 取PCR 扩增产物10μl，加2μl 的loading buffer(6 ×)充分混匀后加到1.5%琼脂糖凝胶上样孔中，通电，电泳至溴酚蓝染料到达凝胶最前沿后停止电泳。

结果表明，SW480 细胞经不同浓度湿生扁蕾处理24 h后，Bcl-2 mRNA 的表达随浓度增加而减少，而Bax mRNA表达随浓度增加而增多，并呈现明显的剂量依赖关系。湿生扁蕾对SW480 细胞Bcl -2 mRNA 及BaxmRNA 表达的电泳图见图1、图2。

图1 湿生扁蕾对SW480 细胞Bcl-2mRNA及BaxmRNA 表达的电泳图(内参GAPDH)

图2 湿生扁蕾对SW480 细胞Bcl-2 mRNA及BaxmRNA 表达的电泳图(内参β-actin)

3 讨 论

细胞凋亡是由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序而导致的细胞死亡过程，适度适时的细胞凋亡是维持细胞群体数量稳态的重要手段，而如果凋亡失调就会影像机体的正常生长、发育，并可导致各种疾病［10］。肿瘤是机体在各种滞留因素的作用下，细胞生长调控发生严重紊乱、细胞异常增殖而形成的新生物，常表现为局部的异常组织团块［11］。

目前认为，肿瘤的发生与细胞凋亡不足密切相关。Bcl-2 家族的成员是高等动物中生存和死亡信号重要的整合因子。该家族成员分为三大类，抗凋亡基因，如Bcl-2、Bcl-XL 等;促凋亡基因，如Bax、Bak 等;双向调控基因，如c-myc，Bclx［12］。其中Bcl-2 和Bax 表达的比例是决定细胞凋亡与否的关键。Bcl -2 本身的活性受相关蛋白Bax的调节，Bax 增高时能和Bcl -2 形成异二聚体(Bcl -2 -Bax)，抑制Bcl-2 的功能从而抑制细胞凋亡，反之则形成二聚体(Bax-Bax)诱导凋亡［13，14］。因此，Bax/Bcl-2 的比例决定了细胞对凋亡刺激的敏感性，最终决定了细胞的生存和死亡。

本实验结果表明，藏药湿生扁蕾作用结肠癌SW480 细胞24 h 后，Bcl -2 mRNA 的表达减少，而Bax mRNA 表达增多，并呈现明显的剂量依赖关系。说明湿生扁蕾引起凋亡基因Bcl-2、Bax 表达的变化可能是其促进SW480 细胞凋亡的机制之一，而通过湿生扁蕾对SW480 细胞Bcl -2、Bax 表达的的调节可能有助于改善结肠癌患者的病情及生存状况。

［1］Jemal A，Bray F，Center MM，et a1.Global Cancer Statistics［J］.CA Cancer J Clin，2011，61(2) ：69 -90.

［2］Sanoff HK，Sargent DJ，Campbell ME，et al. Five -year data and prognostic factor analysis of oxaliplatin and irinotecan combinations for advanced colorectal cancer： N9741［J］.J Clin Oncol，2008，26(35) ： 5721 -5727.

［3］李宝国.结肠癌诊治的回顾与展望［J］. 齐齐哈尔医学院学报，2010，31(13) ：2124 -2125.

［4］Ransohoff DF. How much does colonoscopy reduce colon cancer mortality［J］. Ann Intern Med，2009，150(1) ：50-52.

［5］Efremidou EI，Liratzopoulos N，Papageorgiou SM，et a1.Colorectal carcinoma：correlation between age，gender and subsite distribution［J］. Chirurgia( Bucur) ，2008，103(6) ：659 -663.

［6］Kingham TP，Pachter HL. Colonic anastomotic leak： risk factors，diagnosis，and Treatment［J］. J Am Coll Surg，2009，208(6) ：1152 -1153.

［7］王焕弟，谭成玉，白雪芳，等.藏药湿生扁蕾的抑菌作用研究［J］.时珍国医药，2006，17(10) ：190.

［8］张宝琛，甄润德，胡柏林等. 湿生扁蕾化学成分的研究［J］.中草药，1980，11：149 -151.

［9］米琴，曹长年，赵宙兴，等. 藏药湿生扁蕾有效成份的研究［J］.青海师范大学学报( 自然科学版) ，2005，2：64 -66.

［10］ang JZ，Chen GQ. Textbook of Pathophysiology ( M)2006； 12：154 -165.

［11］李玉林.病理学［M］. 第7 版.北京：人民卫生出版社，2008. 5：76 -77.

［12］Ola MS，Nawaz M，Ahsan H.Role of Bcl-2 family proteins and caspases in the regulation of apoptosis［J］. Mol Cell Biochem，2011，351(1 -2) ：41 -58.

［13］樊蔚虹，姚建平，赵文景. 柴胡疏肝散对卒中后抑郁大鼠海马组织Bcl-2，Bax 蛋白表达的影响［J］.中国实验方剂学杂志，2011，17(3) ：181 -183.

［14］张力，龚明玉，李毅学，等. 放疗联合热疗诱导HepG2 细胞凋亡及其与Bcl -2 和Bax 蛋白表达关系的研究［J］. 中国全科医学，2011，14( 2C) ： 627 -630.