黄精根茎高效离体再生体系的建立

黄登艳　陈泽雄

摘要：以黄精（Polygonatum sibiricum Delar. ex Redoute）根茎为试材，研究不同培养基组合对黄精根茎离体再生的影响。结果表明，黄精根茎最佳诱导培养基为MS+4.0 mg/L 6-BA +0.2 mg/L NAA，最佳增殖培养基为MS+2.0 mg/L 6-BA +1.0 mg/L TDZ +0.1 mg/L IBA，最佳生根培养基为1/2 MS+0.5 mg/L NAA +0.5 mg/L IBA +50 mg/L AC。

关键词：黄精（Polygonatum sibiricum Delar. ex Redoute）；根茎；离体再生

中图分类号：R282；Q813.1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）05-1182-03

黄精（Polygonatum sibiricum Delar. ex Redoute）是百合科黄精属（Polygonatum Mill.）多种植物根茎的总称，为多年生宿根性草本药用植物，其根茎是传统中药[1]。《中华人民共和国药典》2005年版（一部）规定黄精、多花黄精（P. cyrtonema Hua）及滇黄精（P. kingianum Coll. et Hemsl.）3种植物为其原生药来源[1]。黄精含多糖、氨基酸、蒽醌类化合物等成分，具有抗菌、降压、抗衰老及治疗风湿痛等作用[2]。随着黄精药用价值和保健价值的开发，其原料的需求量也越来越大，导致对野生黄精的掠夺性采集，给黄精的开发利用和可持续发展带来不利影响。因此，为了保证黄精原料来源，实行产业化种植势在必行。李世等[3]对黄精的野生变家种栽培进行了研究，而且有些地方也开始人工种植黄精[4，5]，但由于生产上多采用分根繁殖，其繁殖系数低，种根茎用量大，既不经济，又限制了黄精的产量，不便栽植管理与推广，而且长期的分根无性繁殖容易引起黄精品种退化[6]，故黄精种苗问题成了人工大面积种植的瓶颈。利用植物组织培养技术建立黄精离体再生体系是生产优质黄精种苗的有效途径，但通过组织培养实现黄精产业化的研究鲜见报道。为此，笔者以黄精根茎为试材，研究了不同培养基组合对黄精离体再生的影响，以期为黄精离体再生体系的建立、产业化种植提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

黄精根茎由重庆市彭水县林业局提供。

1.2 试验方法

1.2.1 无菌体系的建立 选择晴天挖取黄精根茎，刷掉黄精根茎泥土，用流水冲洗20～30 min，取2 cm左右的初生芽放进洗衣粉溶液中浸泡3～5 min，再用流水冲洗干净。将洗干净的芽用 0.1%氯化汞处理10 min左右（视芽的老嫩程度而定），用无菌水清洗4次，将暴露在消毒液中的根茎组织切除，将芽接种于诱导培养基上。

1.2.2 芽诱导培养 诱导培养基以MS为基本培养基，添加不同浓度的分裂素，不同种类的分裂素和生长素组合见表1。在表1培养基中均添加30 g/L蔗糖、4 g/L琼脂，pH调至5.8，暗培养7 d后光照培养。每个处理接种30瓶，每瓶接种根茎1个，3次重复。30 d后观察并统计其根茎的出芽率以及生长情况。筛选出适合黄精根茎的最佳诱导培养基。培养条件均为温度（25±2） ℃，光照12 h/d，光照度1 500 lx。

1.2.3 增殖培养 将无菌体系中健康的小芽切成单芽，转入增殖培养基中，培养基设计见表2。每个处理接种30瓶，每瓶接种根茎1个，3次重复。接种后40 d转接1次，连续继代3次后统计增殖率、平均成苗率及芽苗的生长情况。

1.2.4 生根培养 将增殖培养中健壮、高3～5 cm的不定芽带少许老组织切割下来，接种到生根培养基上，分别选用MS和1/2MS为基本培养基，添加不同浓度的NAA和IBA，蔗糖20 g/L，卡拉胶5 g/L。培养15 d后就陆续有根产生，继续在此培养基上培养20 d后观察，统计其生根率、平均根数和平均根长。

生根率= 生根的外植体数/接种的外植体数×100%

平均根数=生根总数/接种外植体数

平均根长=根的总长度/根的总数

2 结果与分析

2.1 不同激素类型和浓度对黄精根茎芽诱导的影响

试验以MS培养基为基本培养基，添加不同类型和不同浓度的激素。为了筛选出适宜黄精根茎芽诱导的最佳培养基，设置了6种不同分裂素类型及浓度的组合，结果见表1。从表1可见，相同浓度不同激素类型的培养基对黄精根茎芽的诱导影响很大，添加6-BA的培养基诱导率高于添加TDZ的培养基，当6-BA的浓度达4.0 mg/L时，其诱导率达到最高，为82.22%，芽浓绿，生长快。相同激素类型不同浓度的培养基对黄精根茎芽诱导的影响也较大，随着分裂素浓度的升高，其诱导率呈上升趋势，芽的生长速度加快。因此，黄精根茎芽诱导的最佳培养基配方为MS+4.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA组合（图1）。

2.2 不同激素浓度组合对黄精根茎芽增殖的影响

黄精组织培养中芽的增殖数量直接影响组培效率和繁殖系数，以MS为基本培养基，添加不同浓度组合的激素6-BA、TDZ、NAA和IBA对黄精根茎的芽进行增殖培养，连续转接3代后统计其结果见表2。从表2可见，黄精根茎芽在添加激素组合为2.0 mg/L 6-BA +1.0 mg/L TDZ +0.1 mg/L IBA的培养基中长势最好，其增殖系数达到最高，为2.69，平均株高最高为1.75 cm，并且增殖的芽健壮，叶片正常，生长速度快（图2）。

6-BA和TDZ对黄精根茎芽增殖的影响均较大，当6-BA浓度逐渐增加，TDZ的浓度逐渐降低时，其增殖系数先升高再降低；当6-BA浓度为2.0 mg/L，TDZ浓度为1.0 mg/L，且添加0.1 mg/L IBA时其增殖率最高，芽平均株高最高，芽的生长状况最佳。当再增加6-BA的浓度，同时降低TDZ的浓度，其增殖条数逐渐下降，芽的生长状况也随之变弱，植株玻璃化、矮化。综合增殖系数，平均株高和芽的生长状态，黄精根茎芽增殖的最佳培养基组合为MS+2.0 mg/L 6-BA +1.0 mg/L TDZ +0.1 mg/L IBA。

2.3 基本培养基和植物生长调节剂对黄精根茎芽苗生根的影响

在1/2MS、MS培养基中添加不同浓度的植物生长调节剂（NAA、IBA、6-BA）和活性炭（AC）对黄精进行生根培养，选择生长健壮、高3～5 cm的根茎芽切割下来，基部稍带一点老组织，培养15 d后可见基部有白色的根系生长出来，30 d后统计结果见表3。由表3可见，8种培养基都能使黄精根茎芽苗生根，但以1/2MS为基本培养的培养基组合中生根情况普遍比MS为基本培养基的好。不同生长调节剂对黄精根茎芽苗生根的影响也较大，只添加NNA时比只添加IBA的生根率相对要高，叶型叶色正常；生根培养基C8中添加了少许分裂素6-BA，有利于黄精根茎芽苗的生根；生根培养基C3和C6中将NAA和IBA等浓度混合，并添加少量活性炭后生根率有明显提高；当生根培养基C3以1/2MS为基本培养基，添加0.5 mg/L NAA、0.5 mg/L IBA和50 mg/L AC时其生根率达到最高，为88.89%，平均根数为4.17条，平均根长为1.13 cm，并且芽健壮，叶型叶色正常（图3）。因此，适合黄精根茎芽苗生根的培养基组合为1/2 MS+0.5 mg/L NAA +0.5 mg/L IBA +50 mg/L AC。

3 小结与讨论

本试验结果表明，诱导黄精各器官发生的最佳培养基组合是不同的，说明不同器官的发生对同一植物生长调节剂的反应不同。这和孙敬三等[7]的研究结果一样，即器官发生和植物生长调节剂的种类及浓度有关，适合于芽分化及增殖的植物生长调节剂组合，在诱导根形成时，往往需要改变其种类和浓度，才能得到最佳效果。

在黄精的增殖过程中还发现蔗糖浓度会直接影响芽的大小和增殖情况，当蔗糖达到较高浓度60 g/L时，对芽的形成和生长有利，如蔗糖浓度降到30 g/L时，芽的数量明显减少，并且很快抽出叶片长成完整植株，具体影响程度有待进一步研究。

TDZ是具有很强细胞分裂素活性的人工合成激素，经多种植物组织培养试验表明，对愈伤组织发生、离体芽增殖及再生有显著的促进作用，但对植物生根有抑制作用[8]。本试验结果表明，TDZ对黄精根茎芽的诱导作用不如6-BA明显，但在芽的增殖过程中添加适量的TDZ对黄精根茎芽的分化作用效果明显。本试验得出适合黄精根茎芽增殖的培养基组合为MS+2.0 mg/L 6-BA +1.0 mg/L TDZ +0.1 mg/L IBA。

在诱导黄精根茎芽生根的过程中，基本培养基最为重要，直接影响其生根率和平均根数，生长素NAA 诱导生根的作用较IBA好，不但影响其生根率、平均根数，还直接影响芽苗的健康程度。本试验得出适合黄精根茎芽生根的最佳培养基组合为1/2 MS +0.5 mg/L NAA +0.5 mg/L IBA +50 mg/L AC。

参考文献：

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].北京：化学工业出版社，2005.

[2] 江苏新医学院.中药大辞典[M].上海：上海科学技术出版社，1986.

[3] 李 世，郭学鉴，苏淑欣，等.黄精野生变家种高产高效栽培技术研究[J].中国中药杂志，1997，7（22）：398-401.

[4] 杨子龙，王世清，左敏.黄精高产栽培技术[J].安徽技术师范学院学报，2002，16（1）：51-52.

[5] 宋东平，吴维春，丁志国.东北黄精栽培技术[J].特种经济动植物，2004（9）：21.

[6] 赵 致，庞玉新，袁媛，等.药用作物黄精栽培研究进展及栽培的几个关键问题[J].贵州农业科学，2005，33（1）：85-86.

[7] 孙敬三，朱至清.植物细胞工程实验技术[M].北京：化学工业出版社，2006.

[8] 徐华松，徐九龙，黄学林.TDZ在植物组织培养中的作用[J].广西植物，1996，16（1）：77-80.

2.3 基本培养基和植物生长调节剂对黄精根茎芽苗生根的影响

在1/2MS、MS培养基中添加不同浓度的植物生长调节剂（NAA、IBA、6-BA）和活性炭（AC）对黄精进行生根培养，选择生长健壮、高3～5 cm的根茎芽切割下来，基部稍带一点老组织，培养15 d后可见基部有白色的根系生长出来，30 d后统计结果见表3。由表3可见，8种培养基都能使黄精根茎芽苗生根，但以1/2MS为基本培养的培养基组合中生根情况普遍比MS为基本培养基的好。不同生长调节剂对黄精根茎芽苗生根的影响也较大，只添加NNA时比只添加IBA的生根率相对要高，叶型叶色正常；生根培养基C8中添加了少许分裂素6-BA，有利于黄精根茎芽苗的生根；生根培养基C3和C6中将NAA和IBA等浓度混合，并添加少量活性炭后生根率有明显提高；当生根培养基C3以1/2MS为基本培养基，添加0.5 mg/L NAA、0.5 mg/L IBA和50 mg/L AC时其生根率达到最高，为88.89%，平均根数为4.17条，平均根长为1.13 cm，并且芽健壮，叶型叶色正常（图3）。因此，适合黄精根茎芽苗生根的培养基组合为1/2 MS+0.5 mg/L NAA +0.5 mg/L IBA +50 mg/L AC。

3 小结与讨论

本试验结果表明，诱导黄精各器官发生的最佳培养基组合是不同的，说明不同器官的发生对同一植物生长调节剂的反应不同。这和孙敬三等[7]的研究结果一样，即器官发生和植物生长调节剂的种类及浓度有关，适合于芽分化及增殖的植物生长调节剂组合，在诱导根形成时，往往需要改变其种类和浓度，才能得到最佳效果。

在黄精的增殖过程中还发现蔗糖浓度会直接影响芽的大小和增殖情况，当蔗糖达到较高浓度60 g/L时，对芽的形成和生长有利，如蔗糖浓度降到30 g/L时，芽的数量明显减少，并且很快抽出叶片长成完整植株，具体影响程度有待进一步研究。

TDZ是具有很强细胞分裂素活性的人工合成激素，经多种植物组织培养试验表明，对愈伤组织发生、离体芽增殖及再生有显著的促进作用，但对植物生根有抑制作用[8]。本试验结果表明，TDZ对黄精根茎芽的诱导作用不如6-BA明显，但在芽的增殖过程中添加适量的TDZ对黄精根茎芽的分化作用效果明显。本试验得出适合黄精根茎芽增殖的培养基组合为MS+2.0 mg/L 6-BA +1.0 mg/L TDZ +0.1 mg/L IBA。

在诱导黄精根茎芽生根的过程中，基本培养基最为重要，直接影响其生根率和平均根数，生长素NAA 诱导生根的作用较IBA好，不但影响其生根率、平均根数，还直接影响芽苗的健康程度。本试验得出适合黄精根茎芽生根的最佳培养基组合为1/2 MS +0.5 mg/L NAA +0.5 mg/L IBA +50 mg/L AC。

参考文献：

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].北京：化学工业出版社，2005.

[2] 江苏新医学院.中药大辞典[M].上海：上海科学技术出版社，1986.

[3] 李 世，郭学鉴，苏淑欣，等.黄精野生变家种高产高效栽培技术研究[J].中国中药杂志，1997，7（22）：398-401.

[4] 杨子龙，王世清，左敏.黄精高产栽培技术[J].安徽技术师范学院学报，2002，16（1）：51-52.

[5] 宋东平，吴维春，丁志国.东北黄精栽培技术[J].特种经济动植物，2004（9）：21.

[6] 赵 致，庞玉新，袁媛，等.药用作物黄精栽培研究进展及栽培的几个关键问题[J].贵州农业科学，2005，33（1）：85-86.

[7] 孙敬三，朱至清.植物细胞工程实验技术[M].北京：化学工业出版社，2006.

[8] 徐华松，徐九龙，黄学林.TDZ在植物组织培养中的作用[J].广西植物，1996，16（1）：77-80.

2.3 基本培养基和植物生长调节剂对黄精根茎芽苗生根的影响

在1/2MS、MS培养基中添加不同浓度的植物生长调节剂（NAA、IBA、6-BA）和活性炭（AC）对黄精进行生根培养，选择生长健壮、高3～5 cm的根茎芽切割下来，基部稍带一点老组织，培养15 d后可见基部有白色的根系生长出来，30 d后统计结果见表3。由表3可见，8种培养基都能使黄精根茎芽苗生根，但以1/2MS为基本培养的培养基组合中生根情况普遍比MS为基本培养基的好。不同生长调节剂对黄精根茎芽苗生根的影响也较大，只添加NNA时比只添加IBA的生根率相对要高，叶型叶色正常；生根培养基C8中添加了少许分裂素6-BA，有利于黄精根茎芽苗的生根；生根培养基C3和C6中将NAA和IBA等浓度混合，并添加少量活性炭后生根率有明显提高；当生根培养基C3以1/2MS为基本培养基，添加0.5 mg/L NAA、0.5 mg/L IBA和50 mg/L AC时其生根率达到最高，为88.89%，平均根数为4.17条，平均根长为1.13 cm，并且芽健壮，叶型叶色正常（图3）。因此，适合黄精根茎芽苗生根的培养基组合为1/2 MS+0.5 mg/L NAA +0.5 mg/L IBA +50 mg/L AC。

3 小结与讨论

本试验结果表明，诱导黄精各器官发生的最佳培养基组合是不同的，说明不同器官的发生对同一植物生长调节剂的反应不同。这和孙敬三等[7]的研究结果一样，即器官发生和植物生长调节剂的种类及浓度有关，适合于芽分化及增殖的植物生长调节剂组合，在诱导根形成时，往往需要改变其种类和浓度，才能得到最佳效果。

在黄精的增殖过程中还发现蔗糖浓度会直接影响芽的大小和增殖情况，当蔗糖达到较高浓度60 g/L时，对芽的形成和生长有利，如蔗糖浓度降到30 g/L时，芽的数量明显减少，并且很快抽出叶片长成完整植株，具体影响程度有待进一步研究。

TDZ是具有很强细胞分裂素活性的人工合成激素，经多种植物组织培养试验表明，对愈伤组织发生、离体芽增殖及再生有显著的促进作用，但对植物生根有抑制作用[8]。本试验结果表明，TDZ对黄精根茎芽的诱导作用不如6-BA明显，但在芽的增殖过程中添加适量的TDZ对黄精根茎芽的分化作用效果明显。本试验得出适合黄精根茎芽增殖的培养基组合为MS+2.0 mg/L 6-BA +1.0 mg/L TDZ +0.1 mg/L IBA。

在诱导黄精根茎芽生根的过程中，基本培养基最为重要，直接影响其生根率和平均根数，生长素NAA 诱导生根的作用较IBA好，不但影响其生根率、平均根数，还直接影响芽苗的健康程度。本试验得出适合黄精根茎芽生根的最佳培养基组合为1/2 MS +0.5 mg/L NAA +0.5 mg/L IBA +50 mg/L AC。

参考文献：

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].北京：化学工业出版社，2005.

[2] 江苏新医学院.中药大辞典[M].上海：上海科学技术出版社，1986.

[3] 李 世，郭学鉴，苏淑欣，等.黄精野生变家种高产高效栽培技术研究[J].中国中药杂志，1997，7（22）：398-401.

[4] 杨子龙，王世清，左敏.黄精高产栽培技术[J].安徽技术师范学院学报，2002，16（1）：51-52.

[5] 宋东平，吴维春，丁志国.东北黄精栽培技术[J].特种经济动植物，2004（9）：21.

[6] 赵 致，庞玉新，袁媛，等.药用作物黄精栽培研究进展及栽培的几个关键问题[J].贵州农业科学，2005，33（1）：85-86.

[7] 孙敬三，朱至清.植物细胞工程实验技术[M].北京：化学工业出版社，2006.

[8] 徐华松，徐九龙，黄学林.TDZ在植物组织培养中的作用[J].广西植物，1996，16（1）：77-80.