水稻OsMPK14基因在光敏色素A和B突变体中的差异表达特性

李咪咪　刘洪梅　张帆　梁卫红

摘要：以日本晴（Wt）和光敏色素A、B的突变体（phyA，phyB）3个水稻（Oryza stiva L.）粳稻品种为试材，检测其在生长发育过程中叶片组织的叶绿素含量，并采用半定量RT-PCR和实时定量PCR技术，检测水稻MAPK基因OsMPK14在叶片中的表达特性。结果表明，在水稻生长发育过程中，光敏色素A和B的突变叶片叶绿素含量呈下降趋势；表达模式分析显示，OsMPK14基因在3个水稻品种的叶片中具有不同水平的表达，在Wt和phyA植株叶片中的表达呈现出波动性，而在phyB中随着生长进程的延续呈上升趋势。

关键词：水稻（Oryza stiva L.）；光敏色素突变体；OsMPK14基因；叶绿素含量；表达特性

中图分类号：S511；Q75 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）05-1178-04

对高等植物来说，光不仅能决定植物的光合作用，而且是调控植物生长发育和代谢活动的重要环境信号分子[1]。对于生长环境中光条件的变化，高等植物主要是利用光敏色素（Phytochromes，phy）、隐花色素（Cryptochromes）和向光素（Phototropins）这三种光受体，通过一系列复杂的信号转导反应来调节自身的生长发育，最终适应周围环境的变化[1-4]。

光敏色素主要感受红光和远红光信号[3，5]。水稻（Oryza stiva L.）中一共有3个编码光敏色素的基因，即PHYA、PHYB和PHYC，它们都是单拷贝且均位于水稻的第3号染色体上[1，4]。利用反转座子和γ射线诱变的方法，Takano等[5]研究获得了水稻光敏色素A和B的突变体。已有研究表明，水稻光敏色素在水稻幼苗去黄化[3，6，7]、根的伸长[8]和向地性[7]、植株形态[9]等发育过程中起重要作用。

MAPK是一类存在于所有真核生物中、高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。MAPK和其上游的MAPKK（MAPK激酶）、MAPKKK（MAPKK激酶）共同组成一条重要的信号传递途径。研究显示，MAPK 级联反应参与植物的生长发育[10]、生物及非生物胁迫反应[11，12]、激素应答[13]、细胞分化和发育调控[10，14]等生命过程。但是，有关光敏色素光信号在调节MAPK基因表达方面的研究尚未见报道。

全基因组序列预测分析表明，水稻中有17种MAPK基因，分别被命名为OsMPK1～OsMPK17，并将其划分为A～F 6组[15]。研究表明，MAPK参与水稻生物和非生物胁迫应答以及水稻生长发育过程[16]，如OsMKK4-OsMPK3/OsMPK6可通过调节生物合成基因的表达，从而产生双萜类植物抗毒素[17]。在水稻生长发育后期，OsMPK4基因的表达量在叶、根和幼穗中都有所增加[18，19]。Jeong等[20]研究发现OsMPK7基因在水稻根中有很强的组成型表达。

河南师范大学植物生长发育调控实验室采用序列拼接和RT-PCR技术，克隆了水稻OsMPK14基因完整的cDNA编码区，表达模式分析显示，该基因在水稻不同组织中广泛且差异表达，且在地上部分的表达可能受光照的负调控[21]。为了深入研究该基因在水稻整个生长发育过程中的表达特性，以及与光敏色素光信号通路之间的关系，本研究以水稻粳稻品种日本晴（Oryza sativa L.，Japonica cv. Nipponbare）和光敏色素A、B的突变体为材料，分别采用半定量RT-PCR和实时定量PCR技术，分析了OsMPK14基因在叶片中的表达特性，旨在了解在水稻发育过程中光敏色素光信号通路对OsMPK14基因表达的影响。

1 材料和方法

1.1 供试材料

粳稻品种日本晴野生型（简称Wt）、具有日本晴遗传背景的光敏色素A突变体（phyA）和光敏色素B突变体（phyB），由山东省农业科学院高新技术研究中心谢先芝研究员馈赠。

1.2 供试试剂

PCR相关试剂和总RNA提取试剂TRNzol[天根生化科技（北京）有限公司]、M-MLV反转录酶（Promega生物技术有限公司）、DNaseⅠ酶（Fermentas 生物技术有限公司）、PrimeScript？誖 RT Enzyme Mix Ⅰ和SYBR？誖 Premix Ex TaqTM[宝生物工程（大连）有限公司]。

1.3 方法

用75%乙醇将水稻种子完全消毒后，于2012年5月3日点种于河南师范大学生物试验园地，30、60、90 d时取植株顶部完全伸展且无任何损伤的叶片，用于叶绿素含量的测定和总RNA的提取。

1.3.1 叶绿素含量的测定 利用乙醇法[22]萃取叶绿素，并于722N型可见光分光光度计上测定萃取液在波长645 nm和663 nm下的吸光度，分别按照以下公式计算。

叶绿素A浓度（Ca，mg/L）=13.95A663 nm-6.88A645 nm

叶绿素B浓度（Ca，mg/L）=24.96A645 nm-7.32A663 nm

总叶绿素浓度（Ca，mg/L）=叶绿素A浓度+叶绿素B浓度

叶绿素含量（mg/g）=（叶绿素浓度×提取液体积×稀释倍数）/样品鲜重

1.3.2 总RNA的提取 按TRNzol试剂说明书，提取水稻叶片总RNA，并通过DNA快速电泳检测总RNA质量，并根据A260 nm/A280 nm比值确定其纯度及浓度。

1.3.3 半定量RT-PCR检测 按M-MLV反转录酶说明书进行cDNA的合成。采用25 μL反转录体系，反应体系：1 μL Oligo（dT）15（0.5 μg/μL）、0.63 μL RNA酶抑制剂（40 U/μL ）、5 μL dNTP Mix（10 mmol/L）和 M-MLV RT Buffer（5×）、1 μL M-MLV RT（200 U/μL）、总RNA取1 μg，补加RNase-free 水至25 μL。

以水稻肌动蛋白基因OsAct1作为内参进行半定量RT-PCR，所用引物为P1/P2（表1）。PCR扩增条件：94 ℃预变性 1 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，24个循环；72 ℃终延伸5 min。OsMPK14扩增引物为P3/P4（表1）。PCR扩增条件：94 ℃预变性 1 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，24个循环；72 ℃终延伸5 min。以1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。

1.3.4 qRT-PCR检测 采用40 μL反转录体系合成cDNA，反应体系2 μL Oligo（dT）15（50 μmol/L）和随机6聚引物（100 μmol/L）、8 μL PrimeScript？誖 Buffer（5×）、2 μL PrimeScript？誖RT Enzyme Mix Ⅰ、总RNA不超过2 μg，补加RNase-free 水至40 μL。

以水稻肌动蛋白基因OsAct1作为内参，所用引物为P5/P6，OsMPK14基因扩增引物为P7/P8（表1）。采用20 μL的反应体系：10 μL SYBR？誖Premix Ex TaqTM（2×）、0.4 μL PCR引物（10 μmol/L）、

0.4 μL ROX Reference Dye Ⅱ（50×）、2 μL cDNA模板、6.8 μL灭菌双蒸水。采用两步法PCR扩增标准程序：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火34 s，进行40个循环。每个样品做3次平行反应。

1.3.5 数据分析 数据统计和显著性分析采用SPASS V13软件。qRT-PCR数据分析采用SDS Software v 1.4软件，以2-△△Ct法分析OsMPK14基因表达水平。

2 结果与分析

2.1 3个水稻品种生长发育过程中叶绿素含量

随着水稻的生长发育，野生型Wt和光敏色素突变体phyA、phyB水稻叶片中的叶绿素含量均呈现不同的下降，但是在同一时期3个品种叶片中叶绿素含量有一定的差异。其中突变体phyA的叶绿素含量在30 d时低于野生型Wt，但在60 d和90 d时则高于野生型Wt。突变体phyB水稻叶片中的叶绿素含量在3个时期均高于野生型Wt和突变体phyA。

2.2 OsMPK14基因在3个水稻品种叶片中的表达特性

以组成型表达的水稻肌动蛋白基因OsAct1为内参，通过半定量RT-PCR检测OsMPK14基因在日本晴Wt、phyA和phyB 3个水稻品种30、60、90 d时地上部分的时空表达特性（图2）。结果表明，OsMPK14基因在Wt、phyA和phyB水稻叶片中都有表达，但表达水平存在差异。其中30 d时该基因在phyA中的表达量明显高于其他2个品种。

进一步采用qRT-PCR定量检测OsMPK14基因的表达差异（图3）。从图3可以看出，OsMPK14基因在3个水稻品种叶片中广泛表达，且整体变化趋势与半定量RT-PCR的检测结果基本一致。OsMPK14基因在Wt发育的不同时期表达量没有明显的变化，在phyA发育的不同时期呈现出先降低后升高的趋势，其中在30 d的水稻叶片中，OsMPK14基因在phyA中的表达量是在另外2个品种中表达量的2.7倍、4.2倍。而该基因在phyB发育的不同时期表达量则呈持续升高的趋势。

3 小结与讨论

光敏色素信号转导途径中的第二信使有G蛋白、Ca2+、cGMP、二脂酰甘油和IP3等，可诱导叶绿素和花青素生物合成酶基因的表达[23]。有研究表明，拟南芥中的光敏色素B可参与调节叶绿素的合

成[24]。在水稻中光敏色素B感受红光正调控叶绿素的合成，且光敏色素A和B存在功能上的冗余[25]。本研究通过比较3个水稻品种在3个典型时期叶绿素的含量，发现phyA基因在水稻发育早期正调控叶绿素含量，在发育中、后期则负调控叶绿素含量，但是从整体来看phyA突变使水稻叶绿素含量的下降幅度没有野生型下降幅度大。突变体phyB的叶绿素含量在3个时期均高于野生型和突变体phyA，这表明phyB基因在整个发育过程中负调控叶绿素的含量。叶绿素的含量受叶绿素分解代谢和合成代谢的双重调控，叶绿素含量的变化与叶绿素代谢的哪个途径有关，有待进一步研究。

MAPK作为MAPK级联反应的重要组成部分，在应答多种信号中起重要作用。研究表明，MAPK可能参与水稻多种不同生长发育过程[18， 19， 26]。例如，OsMPK2基因在水稻幼苗所有组织中均有表达，但成熟期仅在花器官中表达[27]，OsMPK8基因则在叶中表达水平较高[19]。本研究结果表明，日本晴水稻中OsMPK14基因在叶片中广泛表达，且表达水平维持相对稳定的状态，说明该基因与叶片生长发育密切相关。

光照和OsMPK14基因表达之间有一定的关

联[21]，但是红光和远红光信号对该基因表达的影响尚不清楚，而且水稻光敏色素信号通路与MAPK级联反应之间的联系鲜见报道。本研究采用具有日本晴遗传背景的光敏色素A和B突变体，比较了OsMPK14基因在突变体中的表达特性。结果表明，这2种光敏色素的突变对该基因在叶片中的表达有不同的影响。突变体phyA中，OsMPK14基因在幼苗期（30 d）表达量显著高于对照日本晴，是其2.7倍，说明phyA的突变对该基因的表达在发育早期是促进效应，这一特点也体现在成熟期（90 d，1.7倍）；但在营养生长向生殖生长转换期，phyA突变对该基因的影响不显著。而光敏色素B的突变体phyB在水稻幼苗期时表现为对OsMPK14基因表达的抑制效应，表达量是对照日本晴的60%，当水稻由营养生长向生殖生长转换并且逐渐成熟时，phyB的突变对该基因的表达则为促进效应，分别是其1.2倍和1.6倍。说明由红光/远红光通过光敏色素受体介导的信号通路对OsMPK14基因表达的调控具有发育时期的特异性，且phyA和phyB的作用机制不同，而光对OsMPK14基因表达的调控机制十分复杂，其内在机制尚需深入研究。

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