青海产小叶黑柴胡总皂苷提取工艺的优选

张丹　陶燕铎　颜学伟　曹纬国　王刚

摘要：采用单因素试验与正交试验相结合优化小叶黑柴胡（Bupleurum smithii Wolff var. parvifolium Shan et Y. Li）总皂苷的提取工艺，考察了提取温度、提取溶剂pH、乙醇浓度、料液比（g/mL，下同）、提取次数和提取时间对小叶黑柴胡总皂苷得率的影响。结果表明，小叶黑柴胡总皂苷的较优提取工艺条件为料液比1∶10，乙醇浓度80%，提取次数3次，提取时间1.0 h，提取温度80 ℃，提取溶剂pH为9。该工艺条件下，小叶黑柴胡总皂苷的得率为2.78%。验证试验表明该工艺稳定可行，可为小叶黑柴胡的深入研究提供参考。

关键词：小叶黑柴胡（Bupleurum smithii Wolff var. parvifolium Shan et Y. Li）；总皂苷；提取工艺；正交试验

中图分类号：R284.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）05-1139-03

柴胡为常用中药之一，中国药典[1]规定柴胡药材基源为柴胡（Bupleurum chinense DC.）和狭叶柴胡（Bupleurum scorzonerifdium Willd.），近年来柴胡药材需求量较大，资源紧张，导致柴胡药材价格不断攀升，急需扩大药用资源。小叶黑柴胡（Bupleurum smithii Wolff var. parvifolium Shan et Y. Li）主要分布于青海、宁夏、甘肃、山西和内蒙古等地，资源量较大，为青海、宁夏等地商品柴胡的主流品种[2]。其皂苷类成分与柴胡相似[3]，重庆医科大学中药化学成分研究组前期研究表明小叶黑柴胡中柴胡皂苷a的含量可达到0.5%以上[4]，远高于药典柴胡药材的标准，具有较大的开发利用价值。

本研究拟建立小叶黑柴胡中柴胡总皂苷的较优提取工艺，为纯化制备高纯度的小叶黑柴胡总皂苷奠定基础，提高小叶黑柴胡的生产附加值，以达到对高原特色生物资源深度开发利用的目的。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料与试剂 小叶黑柴胡（购于青海西宁，经中国科学院西北高原生物研究所梅丽娟副研究员鉴定为小叶黑柴胡（Bupleurum smithii Wolff var. parvifolium Shan et Y. Li）。

柴胡皂苷a标准品（中国药品生物制品鉴定所提供，批号：110777-200507）；香兰素、甲醇、95%乙醇、冰醋酸、正丁醇、高氯酸等均为分析纯。

1.1.2 仪器与设备 UV-1800型分光光度计（上海箐华科技仪器有限公司）；数显三用恒温水浴箱（江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司）；旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；F-80型高速粉碎机（金坛市金城国胜实验仪器厂）；AL204型电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多）。

1.2 方法[5-8]

1.2.1 标准品溶液的制备 精密称取柴胡皂苷a标准品9.6 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀即得。

1.2.2 供试品溶液的制备 精密称取小叶黑柴胡粗粉5.0 g，置具塞三角瓶中，加入80%乙醇溶液100 mL，称定质量，浸泡过夜后超声提取60 min，冷却至室温后称重，用80%乙醇溶液补足减失的质量，摇匀后过滤，精密量取续滤液10 mL浓缩至干后，加甲醇溶解、转移至10 mL容量瓶并定容，作为供试品溶液。

1.2.3 最大吸收波长的测定 取柴胡皂苷a标准品溶液和供试品溶液各0.2 mL，分别置10 mL具塞比色管中，挥发干溶剂后，各加入0.2 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液和0.8 mL高氯酸，摇匀，60 ℃恒温水浴加热20 min，取出后置冰水浴中冷却15 min，再加入5 mL冰醋酸，摇匀，在200～800 nm波长范围内扫描。

1.2.4 线性关系的考察 分别精密量取柴胡皂苷a标准品溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL，置10 mL具塞比色管中，按照“1.2.3”操作显色，以第1管做空白对照，于“1.2.3”确定的最大吸收波长下分别测定其吸光度，计算线性回归方程。

1.2.5 小叶黑柴胡总皂苷含量的测定 精密量取供试品溶液0.5 mL置于10 mL具塞比色管中，按照“1.2.3”方法显色后，于“1.2.3”确定的最大吸收波长下测定其吸光度，并依据线性回归方程计算样品中总皂苷的含量。

1.2.6 单因素试验

1）考察提取温度对小叶黑柴胡总皂苷得率的影响。称取小叶黑柴胡粗粉3份，每份约5.0 g，置圆底烧瓶中各加入40 mL 80%的乙醇溶液，分别在70、80、90 ℃ [9]下各回流提取3次，每次1.0 h。合并3次提取液，浓缩至干，加甲醇溶解、转移并定容至100 mL容量瓶中，过滤，取续滤液按照“1.2.5”方法测定并计算样品中总皂苷的含量。

2）考察提取溶剂pH对小叶黑柴胡总皂苷得率的影响。称取小叶黑柴胡粗粉3份，每份约5.0g，置圆底烧瓶中各加入40 mL 80%的乙醇溶液，分别用浓度为30%的氨水调整其pH为7.0、8.0、9.0，于80 ℃水浴下各回流提取3次，每次1.0 h。合并3次提取液，浓缩至干，加甲醇溶解、转移并定容至100 mL容量瓶中，过滤，取续滤液按照“1.2.5”方法测定并计算样品中总皂苷的含量。

1.2.7 正交试验 选取影响小叶黑柴胡总皂苷提取效果的乙醇浓度（A）、料液比（B）（g/mL，下同）、提取次数（C）及提取时间（D）作为考察因素，提取温度与提取溶剂pH的设定依据“1.2.6”试验结果，以小叶黑柴胡总皂苷的得率为考察指标，选用L9（34）正交试验考察各因素对小叶黑柴胡总皂苷提取效果的影响。正交试验因素与水平见表1。

1.2.8 验证试验 分别精密称取3份小叶黑柴胡药材，每份20.0 g，依据单因素试验与正交试验结果优选的工艺条件提取小叶黑柴胡总皂苷，测定并计算其含量。

2 结果与分析

2.1 最大吸收波长的确定

依据“1.2.3”操作，结果标准品和供试品溶液显色后均在612 nm处有较大吸收，因此选择612 nm为测定波长。

2.2 线性关系的考察

依据“1.2.4”测定结果，以吸光度值A为纵坐标，以标准品溶液浓度C为横坐标计算，求得回归方程：A=2.195 C+0.129，r=0.999 2，线性范围为0.096～0.768 mg/mL。

2.3 小叶黑柴胡总皂苷含量测定结果

依据“1.2.5”操作，结果测得小叶黑柴胡药材中总皂苷的含量为2.81%。

2.4 单因素试验结果与分析

2.4.1 提取温度对小叶黑柴胡总皂苷得率的影响 按照“1.2.6”项下提取温度对柴胡总皂苷提取的影响试验操作并测定，70、80、90 ℃ 3个提取温度条件下，小叶黑柴胡总皂苷的得率分别为1.70%、2.24%和1.56%，由此可见提取温度对小叶黑柴胡总皂苷的得率影响较大，其中80 ℃为较优提取温度。

2.4.2 提取溶剂pH对小叶黑柴胡总皂苷得率的影响 试验结果表明，在提取溶剂pH分别为8、9、10 的条件下，小叶黑柴胡总皂苷的得率分别为2.44%、2.48%和2.39%，由此可见提取溶剂pH也是影响小叶黑柴胡总皂苷提取效果的因素之一，其中提取溶剂pH为9时提取效果较好。

2.3 正交试验结果与分析

按照“1.2.7”正交试验设计，以柴胡总皂苷的得率为考察指标，优选小叶黑柴胡总皂苷提取工艺条件，其结果见表2，方差分析结果见表3。

由表2极差分析结果可知，各因素的主次顺序为C、B、D、A，表明提取次数对小叶黑柴胡总皂苷提取效果的影响最大。小叶黑柴胡总皂苷提取的较优工艺条件组合为A3B3C3D1，结合单因素试验结果，得小叶黑柴胡总皂苷较优提取工艺为：料液比1∶10，乙醇浓度80%，提取次数3次，提取时间1.0 h，提取温度80 ℃，提取溶剂pH为9。由表3方差分析结果可知，因素C作用显著，其他因素作用不显著，与极差分析结果相同。

2.4 验证试验结果

依据“1.2.8”项下操作，按照“1.2.5”项下测定，结果测得小叶黑柴胡总皂苷的得率分别为2.75%、2.81%和2.78%，平均为2.78%，表明该工艺稳定可行。

3 小结与讨论

由于影响柴胡皂苷类成分提取的因素较多，本试验采取单因素试验与正交试验相结合考察了提取温度、提取溶剂pH、乙醇浓度、料液比、提取次数和提取时间等因素对小叶黑柴胡总皂苷得率的影响，确定了小叶黑柴胡总皂苷的较优提取工艺为料液比1∶10，乙醇浓度80%，提取次数3次，提取时间1.0 h，提取温度80 ℃，提取溶剂pH为9。对该工艺条件进行了验证试验，小叶黑柴胡总皂苷的得率为2.78%，表明该工艺稳定可行，可为小叶黑柴胡的进一步开发利用提供依据。分析正交试验中各因素对小叶黑柴胡总皂苷提取的影响可知，提取次数对其影响最大，其次单因素考察时发现提取温度对其影响较大，与正交试验中随提取时间增长小叶黑柴胡总皂苷的得率反而下降的结果相吻合，可能与柴胡皂苷类成分在高温条件下不稳定有关，因此在生产过程中需引起重视。与已知其他研究结果[9-11]相比较，青海产小叶黑柴胡中总皂苷的含量明显高于其他地区柴胡中总皂苷的含量，可能与青藏高原特殊的生态环境有关，高原生态条件苛刻，药用植物生长缓慢，相关次生代谢产物含量较高。前期研究也表明小叶黑柴胡与柴胡及狭叶柴胡中皂苷类成分相似，同时小叶黑柴胡为西北地区商品柴胡的主流品种之一，资源量丰富，具有较大的开发价值，可深入研究。

参考文献：

[1] 国家药典委员会.中国药典（2010版），Ⅰ部[S].北京：中国医药科技出版社，2010.263.

[2] 宁夏回族自治区卫生厅.宁夏中药材标准[M].银川：宁夏人民出版社，1993.171.

[3] 王英华，刑世瑞，羽野芳生，等.小叶黑柴胡中皂苷类成分的研

究[J].中国中药杂志，1998，23（2）：96-98.

[4] 曹纬国，陶燕铎，张有金，等.青海产小叶黑柴胡中皂苷类成分的含量分析[J].中国现代应用药学，2012，29（4）：323-326.

[5] 赵 磊，刘本亮，吴福祥，等.柴胡提取工艺的研究[J].中药材，2004，27（10）：764-766.

[6] 肖功胜，杨 云，孙维英，等.柴胡有效成分提取工艺的研究[J].时珍国医国药，2008，19（8）：1829-1830.

[7] 钟巧妮，赵 丽，雷玉霞，等.柴胡总皂苷提取工艺的优化[J].医药导报，2007，26（4）：408-410.

[8] 刘 伟，董诚明，范 婷，等.正交试验法优选柴胡中柴胡皂苷提取工艺[J].中国医院药学杂志，2008，28（16）：1350-1352.

[9] 王 鹏，贾凌云，孙启时，等.不同产地柴胡中柴胡皂苷的含量测定[J].沈阳药科大学学报，2004，21（3）：193-195.

[10] 王 鹏，王玉生，刘 斌.不同产地柴胡中总皂苷及柴胡皂苷a含量测定[J].中国药物与临床，2008，8（3）：228-229.

[11] 李媛媛，秦雪梅，王玉庆，等.柱前衍生化法评价不同品种和产地柴胡药材和饮片的质量[J].中国中药杂志，2008，33（3）：237-240.

1.2.8 验证试验 分别精密称取3份小叶黑柴胡药材，每份20.0 g，依据单因素试验与正交试验结果优选的工艺条件提取小叶黑柴胡总皂苷，测定并计算其含量。

2 结果与分析

2.1 最大吸收波长的确定

依据“1.2.3”操作，结果标准品和供试品溶液显色后均在612 nm处有较大吸收，因此选择612 nm为测定波长。

2.2 线性关系的考察

依据“1.2.4”测定结果，以吸光度值A为纵坐标，以标准品溶液浓度C为横坐标计算，求得回归方程：A=2.195 C+0.129，r=0.999 2，线性范围为0.096～0.768 mg/mL。

2.3 小叶黑柴胡总皂苷含量测定结果

依据“1.2.5”操作，结果测得小叶黑柴胡药材中总皂苷的含量为2.81%。

2.4 单因素试验结果与分析

2.4.1 提取温度对小叶黑柴胡总皂苷得率的影响 按照“1.2.6”项下提取温度对柴胡总皂苷提取的影响试验操作并测定，70、80、90 ℃ 3个提取温度条件下，小叶黑柴胡总皂苷的得率分别为1.70%、2.24%和1.56%，由此可见提取温度对小叶黑柴胡总皂苷的得率影响较大，其中80 ℃为较优提取温度。

2.4.2 提取溶剂pH对小叶黑柴胡总皂苷得率的影响 试验结果表明，在提取溶剂pH分别为8、9、10 的条件下，小叶黑柴胡总皂苷的得率分别为2.44%、2.48%和2.39%，由此可见提取溶剂pH也是影响小叶黑柴胡总皂苷提取效果的因素之一，其中提取溶剂pH为9时提取效果较好。

2.3 正交试验结果与分析

按照“1.2.7”正交试验设计，以柴胡总皂苷的得率为考察指标，优选小叶黑柴胡总皂苷提取工艺条件，其结果见表2，方差分析结果见表3。

由表2极差分析结果可知，各因素的主次顺序为C、B、D、A，表明提取次数对小叶黑柴胡总皂苷提取效果的影响最大。小叶黑柴胡总皂苷提取的较优工艺条件组合为A3B3C3D1，结合单因素试验结果，得小叶黑柴胡总皂苷较优提取工艺为：料液比1∶10，乙醇浓度80%，提取次数3次，提取时间1.0 h，提取温度80 ℃，提取溶剂pH为9。由表3方差分析结果可知，因素C作用显著，其他因素作用不显著，与极差分析结果相同。

2.4 验证试验结果

依据“1.2.8”项下操作，按照“1.2.5”项下测定，结果测得小叶黑柴胡总皂苷的得率分别为2.75%、2.81%和2.78%，平均为2.78%，表明该工艺稳定可行。

3 小结与讨论

由于影响柴胡皂苷类成分提取的因素较多，本试验采取单因素试验与正交试验相结合考察了提取温度、提取溶剂pH、乙醇浓度、料液比、提取次数和提取时间等因素对小叶黑柴胡总皂苷得率的影响，确定了小叶黑柴胡总皂苷的较优提取工艺为料液比1∶10，乙醇浓度80%，提取次数3次，提取时间1.0 h，提取温度80 ℃，提取溶剂pH为9。对该工艺条件进行了验证试验，小叶黑柴胡总皂苷的得率为2.78%，表明该工艺稳定可行，可为小叶黑柴胡的进一步开发利用提供依据。分析正交试验中各因素对小叶黑柴胡总皂苷提取的影响可知，提取次数对其影响最大，其次单因素考察时发现提取温度对其影响较大，与正交试验中随提取时间增长小叶黑柴胡总皂苷的得率反而下降的结果相吻合，可能与柴胡皂苷类成分在高温条件下不稳定有关，因此在生产过程中需引起重视。与已知其他研究结果[9-11]相比较，青海产小叶黑柴胡中总皂苷的含量明显高于其他地区柴胡中总皂苷的含量，可能与青藏高原特殊的生态环境有关，高原生态条件苛刻，药用植物生长缓慢，相关次生代谢产物含量较高。前期研究也表明小叶黑柴胡与柴胡及狭叶柴胡中皂苷类成分相似，同时小叶黑柴胡为西北地区商品柴胡的主流品种之一，资源量丰富，具有较大的开发价值，可深入研究。

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[2] 宁夏回族自治区卫生厅.宁夏中药材标准[M].银川：宁夏人民出版社，1993.171.

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究[J].中国中药杂志，1998，23（2）：96-98.

[4] 曹纬国，陶燕铎，张有金，等.青海产小叶黑柴胡中皂苷类成分的含量分析[J].中国现代应用药学，2012，29（4）：323-326.

[5] 赵 磊，刘本亮，吴福祥，等.柴胡提取工艺的研究[J].中药材，2004，27（10）：764-766.

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[8] 刘 伟，董诚明，范 婷，等.正交试验法优选柴胡中柴胡皂苷提取工艺[J].中国医院药学杂志，2008，28（16）：1350-1352.

[9] 王 鹏，贾凌云，孙启时，等.不同产地柴胡中柴胡皂苷的含量测定[J].沈阳药科大学学报，2004，21（3）：193-195.

[10] 王 鹏，王玉生，刘 斌.不同产地柴胡中总皂苷及柴胡皂苷a含量测定[J].中国药物与临床，2008，8（3）：228-229.

[11] 李媛媛，秦雪梅，王玉庆，等.柱前衍生化法评价不同品种和产地柴胡药材和饮片的质量[J].中国中药杂志，2008，33（3）：237-240.

1.2.8 验证试验 分别精密称取3份小叶黑柴胡药材，每份20.0 g，依据单因素试验与正交试验结果优选的工艺条件提取小叶黑柴胡总皂苷，测定并计算其含量。

2 结果与分析

2.1 最大吸收波长的确定

依据“1.2.3”操作，结果标准品和供试品溶液显色后均在612 nm处有较大吸收，因此选择612 nm为测定波长。

2.2 线性关系的考察

依据“1.2.4”测定结果，以吸光度值A为纵坐标，以标准品溶液浓度C为横坐标计算，求得回归方程：A=2.195 C+0.129，r=0.999 2，线性范围为0.096～0.768 mg/mL。

2.3 小叶黑柴胡总皂苷含量测定结果

依据“1.2.5”操作，结果测得小叶黑柴胡药材中总皂苷的含量为2.81%。

2.4 单因素试验结果与分析

2.4.1 提取温度对小叶黑柴胡总皂苷得率的影响 按照“1.2.6”项下提取温度对柴胡总皂苷提取的影响试验操作并测定，70、80、90 ℃ 3个提取温度条件下，小叶黑柴胡总皂苷的得率分别为1.70%、2.24%和1.56%，由此可见提取温度对小叶黑柴胡总皂苷的得率影响较大，其中80 ℃为较优提取温度。

2.4.2 提取溶剂pH对小叶黑柴胡总皂苷得率的影响 试验结果表明，在提取溶剂pH分别为8、9、10 的条件下，小叶黑柴胡总皂苷的得率分别为2.44%、2.48%和2.39%，由此可见提取溶剂pH也是影响小叶黑柴胡总皂苷提取效果的因素之一，其中提取溶剂pH为9时提取效果较好。

2.3 正交试验结果与分析

按照“1.2.7”正交试验设计，以柴胡总皂苷的得率为考察指标，优选小叶黑柴胡总皂苷提取工艺条件，其结果见表2，方差分析结果见表3。

由表2极差分析结果可知，各因素的主次顺序为C、B、D、A，表明提取次数对小叶黑柴胡总皂苷提取效果的影响最大。小叶黑柴胡总皂苷提取的较优工艺条件组合为A3B3C3D1，结合单因素试验结果，得小叶黑柴胡总皂苷较优提取工艺为：料液比1∶10，乙醇浓度80%，提取次数3次，提取时间1.0 h，提取温度80 ℃，提取溶剂pH为9。由表3方差分析结果可知，因素C作用显著，其他因素作用不显著，与极差分析结果相同。

2.4 验证试验结果

依据“1.2.8”项下操作，按照“1.2.5”项下测定，结果测得小叶黑柴胡总皂苷的得率分别为2.75%、2.81%和2.78%，平均为2.78%，表明该工艺稳定可行。

3 小结与讨论

由于影响柴胡皂苷类成分提取的因素较多，本试验采取单因素试验与正交试验相结合考察了提取温度、提取溶剂pH、乙醇浓度、料液比、提取次数和提取时间等因素对小叶黑柴胡总皂苷得率的影响，确定了小叶黑柴胡总皂苷的较优提取工艺为料液比1∶10，乙醇浓度80%，提取次数3次，提取时间1.0 h，提取温度80 ℃，提取溶剂pH为9。对该工艺条件进行了验证试验，小叶黑柴胡总皂苷的得率为2.78%，表明该工艺稳定可行，可为小叶黑柴胡的进一步开发利用提供依据。分析正交试验中各因素对小叶黑柴胡总皂苷提取的影响可知，提取次数对其影响最大，其次单因素考察时发现提取温度对其影响较大，与正交试验中随提取时间增长小叶黑柴胡总皂苷的得率反而下降的结果相吻合，可能与柴胡皂苷类成分在高温条件下不稳定有关，因此在生产过程中需引起重视。与已知其他研究结果[9-11]相比较，青海产小叶黑柴胡中总皂苷的含量明显高于其他地区柴胡中总皂苷的含量，可能与青藏高原特殊的生态环境有关，高原生态条件苛刻，药用植物生长缓慢，相关次生代谢产物含量较高。前期研究也表明小叶黑柴胡与柴胡及狭叶柴胡中皂苷类成分相似，同时小叶黑柴胡为西北地区商品柴胡的主流品种之一，资源量丰富，具有较大的开发价值，可深入研究。

参考文献：

[1] 国家药典委员会.中国药典（2010版），Ⅰ部[S].北京：中国医药科技出版社，2010.263.

[2] 宁夏回族自治区卫生厅.宁夏中药材标准[M].银川：宁夏人民出版社，1993.171.

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[8] 刘 伟，董诚明，范 婷，等.正交试验法优选柴胡中柴胡皂苷提取工艺[J].中国医院药学杂志，2008，28（16）：1350-1352.

[9] 王 鹏，贾凌云，孙启时，等.不同产地柴胡中柴胡皂苷的含量测定[J].沈阳药科大学学报，2004，21（3）：193-195.

[10] 王 鹏，王玉生，刘 斌.不同产地柴胡中总皂苷及柴胡皂苷a含量测定[J].中国药物与临床，2008，8（3）：228-229.

[11] 李媛媛，秦雪梅，王玉庆，等.柱前衍生化法评价不同品种和产地柴胡药材和饮片的质量[J].中国中药杂志，2008，33（3）：237-240.