普洱茶冲泡过程中细菌的安全性分析

赵振军　刘勤晋

摘要：以市售普洱茶为研究对象，采用国家标准方法，分别检测普洱茶茶叶和冲泡后各批次茶汤中细菌总数，并采用形态观察与生化试验对从普洱茶汤中分离的细菌进行了鉴定。结果表明，普洱熟茶细菌菌落数多于普洱生茶茶样，同时散茶中细菌菌落数高于紧压茶；普洱茶第一泡茶汤中细菌菌落数超过GB/T 19296-2003小于或等于100 CFU/mL的规定值，且从第一泡茶汤中能检测出致病菌，而其他冲泡批次茶汤中细菌的菌落数与种类都符合安全标准，适合饮用。

关键词：普洱茶；细菌；分离；安全性

中图分类号：TS272.7 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）05-1032-04

普洱茶因具有减肥、降血压、抗氧化[1]、抑制脂肪酸合成酶基因表达[2]，清除自由基 [3]，降低总的胆固醇[4]等多重功效，深受大众喜爱，已经成为人们日常饮品之一。普洱茶是一种后发酵茶，后发酵的本质是微生物参与普洱茶品质的形成，普洱成品茶会不可避免含有一定量微生物。为安全饮用普洱茶起见，与其他茶类的冲泡相比，通常会采用沸水杀菌，并增加一道洗茶工序，进一步去除微生物[5，6]。但关于沸水冲泡是否会减少普洱茶茶汤中微生物种群数量、经沸水冲泡后普洱茶茶汤中是否含有有害菌等的研究鲜见报道。因此，通过对普洱茶沸水冲泡过程中细菌数量变化进行分析，并采用形态观察与生化反应的方式对茶汤中残留的细菌进行鉴定，为普洱茶的安全饮用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

选择当年产普洱生、熟茶茶样6个，购自云南昆明。柠檬酸三钠、硫代硫酸钠、甘露醇、琼脂粉等为北京奥博星生物技术有限责任公司分析纯产品。

营养琼脂培养基：称取本品45 g加入1 000 mL去离子水中，高压灭菌备用。各种染色液、溶液、培养基按照GB/T 4789.28-2003 《食品卫生微生物学检验 染色法、培养基和试剂》说明配制[7]。相关试验操作参见《微生物学实验教程》[8]。兔血浆的制备参见《食品微生物学实验原理与技术》[9]。

1.2 试验方法

1.2.1 茶汤的制备 称取茶叶2.50 g加入250 mL沸水，10 s后倾出茶汤，定容250 mL，即为第1泡茶汤；再加入250 mL沸水于原锥形瓶中，30 s后倒尽茶汤，定容至250 mL，为第2 泡茶汤；依此类推共泡6次，2～6次冲泡时间均为30 s，分取6泡茶汤进行细菌群落分析。

1.2.2 细菌的分离与计数 茶样及茶汤中细菌的分离与计数采用平板稀释法，参照GB/T4789.2-2003《食品卫生微生物学检验 菌落总数测定》[10]进行。6个茶样冲泡茶汤菌落数取平均值。

1.2.3 细菌形态鉴定 菌落形态观察：观察记录菌落在营养琼脂培养基上的大小、颜色、质地等。菌体形态观察：革兰氏染色，将细菌均匀涂布在载玻片上，镜下观察并记录细菌形态。

1.2.4 细菌生理生化鉴定 根据形态观察结果，对菌种进行大致分类（无芽孢杆菌、芽孢杆菌、球菌、弧菌），查阅《伯杰细菌鉴定手册》[11]，确定所要鉴定的各菌种的各项生理生化试验：吲哚试验、甲基红试验、VP试验、枸橼酸盐试验、硫化氢试验、尿酶试验、糖（葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖）发酵试验、血浆凝固酶试验等。具体试验操作参照《微生物学实验教程》[8]进行。

2 结果与分析

2.1 普洱茶茶样中细菌菌落数

将普洱茶样品采用无菌生理盐水稀释后，采用平板计数法，对从市场上选取的当年产普洱茶中细菌菌落数量进行了统计，普洱茶茶样中细菌菌落计数结果如表1所示。表 1 可知，普洱熟茶细菌菌落数为0.64×102～2.01×104 CFU/g，普洱生茶细菌菌落数为0.50×102～6.73×103 CFU/g，相较而言普洱熟茶细菌菌落数多于普洱生茶，同时散茶中细菌菌落数高于紧压茶，如普洱熟散茶中细菌菌落数最大为2.01×104 CFU/g，而熟砖和熟沱两种紧压茶中细菌菌落数分别为1.59×102和0.64×102 CFU/g，可能与紧压茶压制过程中有一个高温蒸软的过程有关，另从普洱茶样品含水量可以看出，含水量高低与细菌菌落数存在一定的正相关，可能是因为含水量越低的茶样需要烘焙更长的时间，可以杀死更多的细菌。

2.2 不同冲泡次数茶汤中细菌菌落数

对选定的普洱熟茶茶样采用沸水进行冲泡，分次冲泡所得茶汤中细菌菌落数统计，结果如图1所示。由图1可知，随冲泡次数增加，普洱茶茶汤中细菌菌落数逐渐减少，第一次冲泡10 s，茶汤中细菌菌落数为3.12×102 CFU/mL，超过GB/T 19296-2003规定茶饮料中微生物种群数量应小于或等于100 CFU/mL的标准[12]，而二泡之后，茶汤中细菌菌落数为0.97×102 CFU/mL，菌落数已经降低至茶饮料中微生物种群数量最低标准，但是否可以安全饮用，仍取决于菌落中是否含有致病菌。

2.2 不同冲泡次数茶汤中细菌的形态观察

采用平板划线法，对分次冲泡所得茶汤中含有的细菌进行分离纯化，首先通过肉眼或放大镜进行形态观察，根据菌落的大小、颜色、质地等，初步筛选出13株不同的细菌，然后进一步对菌种进行革兰氏染色和显微形态观察。细菌形态描述及显微形态结果见表2。从显微形态可以看出，茶汤中细菌总体来说属于两类：杆菌与球菌。根据不同冲泡次数细菌的分离与形态鉴定结果可知，随冲泡次数增加，不仅菌落数减少，而且细菌种类也明显减少。如第一泡茶汤中含有细菌9种，其中杆菌6种、球菌3种（表2中菌株1～3，5～7，11～13），第二泡茶汤含细菌4种，其中杆菌3种、球菌1种（表2中菌株2，3，12）；第三泡茶汤含细菌2种（1种杆菌，1种球菌，表2中菌株4，9）；第四至第六泡茶汤中含细菌种类均为1种（分别为表2中菌株6，10）。

2.3 茶汤中细菌的生化鉴定

根据其形态特征，初步将筛选出的13株细菌判定为杆菌与球菌，而杆菌中的大肠杆菌，球菌类的金黄色葡萄球菌等都属于致病性细菌，要评价茶汤中细菌的安全性，需要通过相关的生化试验，以确定其致病性。参照《伯杰细菌鉴定手册》[11]，对菌株1～7开展葡萄糖、蔗糖、乳糖、三糖铁斜面等生化试验，发现枸橼酸盐试验呈阴性，显示杆菌1～7不属于克雷伯菌属、沙门菌属，菌株1～4，6发酵乳糖呈阴性，说明菌株1～4，6不属于大肠杆菌，进一步VP试验与甲基红试验呈阴性，说明菌株1～4，6可能属于沙门、志贺、变形、枸橼酸杆菌等，而菌株5在乳糖发酵、VP试验、甲基红试验均呈阳性说明菌株5是大肠杆菌，而其他杆菌1～4，6均不具有致病性。对菌株8～13开展触酶试验，菌株8～12均呈阳性，说明菌株8～12可能是葡萄球菌；通过血浆凝固酶试验，菌株12呈阳性，由此判断菌株12具有致病性，可能是金黄色葡萄球菌；血浆凝固酶试验、胆汁溶菌酶试验菌株13呈阴性，可以排除菌株13属于肺炎链球菌的可能。通过生化试验，可鉴定从普洱茶茶汤中分离的菌株5属于大肠杆菌，菌株12可能属于金黄色葡萄球菌，具有致病性，而其他菌株属于非致病性的杆菌和球菌（表3）。而致病菌均来自普洱茶第一次冲泡的茶汤，可能初次冲泡10 s时间太短，高温沸水尚未将致病菌杀死。

3 结论

普洱茶中含有一定量的细菌，采用沸水冲泡有助于杀灭细菌。普洱茶第一次冲泡的茶汤细菌菌落数超过GB/T 19296-2003规定茶饮料中微生物种群数量应小于或等于100 CFU/mL的标准，而且第一泡中由于沸水作用时间短，普洱茶中的致病菌可能仍然具有活性，所以从安全方面考虑，普洱茶第二泡及后面冲泡的茶水更适合饮用。

参考文献：

[1] CHIANG C T， WENG M S， LIN-SHIAU S Y， et al. Pu-erh tea supplementation suppresses fatty acid synthase expression in the rat liver through down regulating Akt and JNK signalings as demonstrated in human hepatoma HepG2 cells[J].Oncology Research，2006，16（3）：119-128.

[2] DUH P D，YEN G C，YEN W J，et al. Effects of pu-erh tea on oxidative damage and nitric oxide scavenging[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2004，52（26）：8169-8176.

[3] JIE G L， LIN Z， ZHANG L Z， et al. Free radical scavenging effect of Pu-erh tea extracts and their protective effect on oxidative damage in human fibroblast cells[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2006，54（21）：8058-8064.

[4] KUO K L， WENG M S， CHIANG C T， et al. Comparative studies on the hypolipidemic and growth suppressive effects of oolong， black， pu-erh， and green tea leaves in rats[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2005，53（2）：480-489.

[5] 刘勤晋，周才琼，许鸿亮，等.普洱茶的渥堆作用[J].茶叶科学，1986，6（2）：55-56.

[6] 陆松侯，施兆鹏.茶叶审评与检验[M].第三版.北京：中国农业出版社，2001.

[7] GB/T 4789.28-2003，食品卫生微生物学检验 染色法、培养基和试剂[S].

[8] 陈峥宏.微生物学实验教程[M].上海：第二军医大学出版社，2008.

[9] 李平兰，贺稚非.食品微生物学实验原理与技术[M].北京：中国农业出版社，2005.

[10] GB/T 4789.2-2010，食品卫生微生物学检验 菌落总数测定[S].

[11] 布坎南 R E，吉本斯 N E.伯杰细菌鉴定手册[M].第八版. 中国科学院微生物研究所《伯杰细菌鉴定手册》翻译组，译.北京：科学出版社，1984.

[12] GB/T 19296-2003，茶饮料卫生标准[S].

2.3 茶汤中细菌的生化鉴定

根据其形态特征，初步将筛选出的13株细菌判定为杆菌与球菌，而杆菌中的大肠杆菌，球菌类的金黄色葡萄球菌等都属于致病性细菌，要评价茶汤中细菌的安全性，需要通过相关的生化试验，以确定其致病性。参照《伯杰细菌鉴定手册》[11]，对菌株1～7开展葡萄糖、蔗糖、乳糖、三糖铁斜面等生化试验，发现枸橼酸盐试验呈阴性，显示杆菌1～7不属于克雷伯菌属、沙门菌属，菌株1～4，6发酵乳糖呈阴性，说明菌株1～4，6不属于大肠杆菌，进一步VP试验与甲基红试验呈阴性，说明菌株1～4，6可能属于沙门、志贺、变形、枸橼酸杆菌等，而菌株5在乳糖发酵、VP试验、甲基红试验均呈阳性说明菌株5是大肠杆菌，而其他杆菌1～4，6均不具有致病性。对菌株8～13开展触酶试验，菌株8～12均呈阳性，说明菌株8～12可能是葡萄球菌；通过血浆凝固酶试验，菌株12呈阳性，由此判断菌株12具有致病性，可能是金黄色葡萄球菌；血浆凝固酶试验、胆汁溶菌酶试验菌株13呈阴性，可以排除菌株13属于肺炎链球菌的可能。通过生化试验，可鉴定从普洱茶茶汤中分离的菌株5属于大肠杆菌，菌株12可能属于金黄色葡萄球菌，具有致病性，而其他菌株属于非致病性的杆菌和球菌（表3）。而致病菌均来自普洱茶第一次冲泡的茶汤，可能初次冲泡10 s时间太短，高温沸水尚未将致病菌杀死。

3 结论

普洱茶中含有一定量的细菌，采用沸水冲泡有助于杀灭细菌。普洱茶第一次冲泡的茶汤细菌菌落数超过GB/T 19296-2003规定茶饮料中微生物种群数量应小于或等于100 CFU/mL的标准，而且第一泡中由于沸水作用时间短，普洱茶中的致病菌可能仍然具有活性，所以从安全方面考虑，普洱茶第二泡及后面冲泡的茶水更适合饮用。

参考文献：

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2.3 茶汤中细菌的生化鉴定

根据其形态特征，初步将筛选出的13株细菌判定为杆菌与球菌，而杆菌中的大肠杆菌，球菌类的金黄色葡萄球菌等都属于致病性细菌，要评价茶汤中细菌的安全性，需要通过相关的生化试验，以确定其致病性。参照《伯杰细菌鉴定手册》[11]，对菌株1～7开展葡萄糖、蔗糖、乳糖、三糖铁斜面等生化试验，发现枸橼酸盐试验呈阴性，显示杆菌1～7不属于克雷伯菌属、沙门菌属，菌株1～4，6发酵乳糖呈阴性，说明菌株1～4，6不属于大肠杆菌，进一步VP试验与甲基红试验呈阴性，说明菌株1～4，6可能属于沙门、志贺、变形、枸橼酸杆菌等，而菌株5在乳糖发酵、VP试验、甲基红试验均呈阳性说明菌株5是大肠杆菌，而其他杆菌1～4，6均不具有致病性。对菌株8～13开展触酶试验，菌株8～12均呈阳性，说明菌株8～12可能是葡萄球菌；通过血浆凝固酶试验，菌株12呈阳性，由此判断菌株12具有致病性，可能是金黄色葡萄球菌；血浆凝固酶试验、胆汁溶菌酶试验菌株13呈阴性，可以排除菌株13属于肺炎链球菌的可能。通过生化试验，可鉴定从普洱茶茶汤中分离的菌株5属于大肠杆菌，菌株12可能属于金黄色葡萄球菌，具有致病性，而其他菌株属于非致病性的杆菌和球菌（表3）。而致病菌均来自普洱茶第一次冲泡的茶汤，可能初次冲泡10 s时间太短，高温沸水尚未将致病菌杀死。

3 结论

普洱茶中含有一定量的细菌，采用沸水冲泡有助于杀灭细菌。普洱茶第一次冲泡的茶汤细菌菌落数超过GB/T 19296-2003规定茶饮料中微生物种群数量应小于或等于100 CFU/mL的标准，而且第一泡中由于沸水作用时间短，普洱茶中的致病菌可能仍然具有活性，所以从安全方面考虑，普洱茶第二泡及后面冲泡的茶水更适合饮用。

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[12] GB/T 19296-2003，茶饮料卫生标准[S].