DPI染色显示黄姑鱼NOR的方法研究

陈紫瑩，王浩华，王凯武，刘贤德，王志勇，蔡明夷

(1.农业部东海海水健康养殖重点实验室，福建 厦门 361021;2.集美大学水产学院，福建 厦门 361021)

0 引言

染色体的核仁组织区域 (Nucleolar Organizing Region，NOR)含有rRNA基因，能够合成核糖体的28S、18S和5.8S rRNA，常与染色体的次缢痕及核仁的形成有关[1].不同的物种，NORs的位置、数量和大小可能不同，甚至同一物种不同品系的NORs出现的频率也存在多态性.因此，NORs显带技术常用于研究物种的进化、亲缘关系[2].1975年，Matsui和 Sasaki[3]最早提出核仁组织区域(NORs)显带方法.同年，Goodpasture和 Bloom[4]提出利用银染 (Silver Stainings，Ag-NOR)显示核仁组织区的方法.1980年，Howell和Black优化了银染法，提高了操作简便性和结果的稳定性[5].1999年，Peterson等人报道了碘化丙啶 (propidium iodide，PI)和4，6-二氨基-2-苯基吲哚 (4，6-diamidino-2-phenylindole dihydrochl oride，DAPI)组合染色 (combined PI and DAPI，CPD)显示NOR的方法[6].DPI染法是Rab等1996年提出的显示鱼类NOR带的方法，主要步骤包括热甲酰胺变性和PI染色.这种方法具有简便、快速和经济等优势，特别适于规模较大的NOR定位研究[7].

黄姑鱼(Nibea alibiflora，Richardon)隶属鲈形目 (Perciformes)，石首鱼科 (Scieanidae)，黄姑鱼属(Nibea)，主要分布于中国、朝鲜半岛和日本南部沿海[8]，是我国传统渔业的主要捕捞对象之一.近年来，黄姑鱼人工育苗和网箱养殖在我国福建、浙江沿海逐渐发展起来，养殖规模不断扩大.因此，黄姑鱼的遗传基础与育种研究日益受到学界的重视.染色体核型是物种最基本的遗传特征.有关黄姑鱼染色体的相关研究报道已有4篇，其中，王金星等[9]在1号染色体发现明显的次缢痕，喻子牛等[10]在3号染色体发现次缢痕，王晓艳[11]用银染法和18S rDNA荧光原位杂交 (FISH)将黄姑鱼的NOR定位于1号染色体.目前研究NOR普遍使用的是银染法，但是银染法易出现假阳性信号，且主观性强，没有标准化程序.因此，本文研究开发了适用于黄姑鱼的DPI染色方法，以期为黄姑鱼NOR研究提供更加高效、便捷的方法，同时为黄姑鱼染色体变异研究奠定基础，也为其他石首鱼科鱼类NOR定位提供借鉴.

1 材料与方法

1.1 染色体制备

黄姑鱼取自宁德市横屿岛水产有限公司，平均体重约为450 g.头肾染色体标本按文献 [12]的描述方法制备.

1.2 DPI染法条件的优化

1.2.1 操作步骤的确定

DPI染法显示NOR带原始程序包括4个步骤:1)老化:制片在60℃下老化3～6 h;2)甲酰胺/2×SSC处理:放入70℃ 预热体积分数为75%的甲酰胺溶液中处理2.5 min，系列乙醇脱水;3)烘片:70℃下烘片10 min;4)PI染色:滴加含有1 μg/mL PI的封片剂，盖上盖玻片，用指甲油封片.然后，在荧光显微镜 (Olympus BX53)绿光激发通道 (GW)下镜检，检查PI高亮信号.缺失或更换原始程序中的某一步骤来处理制片，检查间期核和中期染色体是否有差别显示出高亮区，以判断原始程序中的4个处理步骤的必要性.其中，NOR有差别显示记为“+”，无差别显示记为“-”.试验重复3次.

1.2.2 甲酰胺处理条件的优化

通过预试验初步确定了DPI染法甲酰胺处理步骤中甲酰胺浓度、温度和处理时间的范围.按照3因子3水平设计正交实验，进一步优化制片甲酰胺处理的条件 (见表1).每个组随机观察100个间期核，记录显示出高亮区的细胞核数，计算显示出NOR的间期核比例.根据正交试验统计结果确定甲酰胺处理的最优条件.同一因素不同水平差异的显著性用SPSS 20.0软件分析.

表1 甲酰胺处理正交试验因素水平表Tab.1 Factors and levels of orthogonal experiment for formamide(FA)treatment

1.2.3 制片烘片条件的优化

预试验结果提示，适度烘片可以提高显带的对比度.因此，本研究开展了烘片的温度和时间试验.其中，烘片温度包括60℃、70℃、80℃3个水平，烘片时间包括5 min、10 min、15 min和20 min 4个水平.用cellSens Standard 1.7软件测量NOR和细胞核区域的平均荧光强度，计算NOR/细胞核区荧光强度比值 (Rnn).各组间Rnn平均值差异的显著性检验用SPSS 20.0软件分析.

1.3 DPI染法与银染法显示NOR结果的比较

DPI染法按优化后程序操作:制片老化后，65℃，在预热的体积分数为80%的甲酰胺溶液中处理4 min，再用系列乙醇脱水，接着放在60℃下烘片5～10 min;滴加含有1 μg/mL PI的封片剂，盖上盖玻片.然后，在荧光显微镜绿光激发通道 (GW)下，检查PI高亮信号.顺序银染的操作参考文献[2]的描述，并作少许修改.观察完DPI信号后，揭去盖玻片，用乙醇洗去PI封片剂，然后按文献 [5]描述的方法进行银染.

比较相同中期相DPI染法和银染法显微摄影图像，以确定两种方法显示区域的一致性.在两种方法获得的图像中，随机400个间期核，计算每个间期核显示NOR的数目;并用cellSens软件测量NORs和细胞核的直径，计算NOR直径/细胞核直径的比值.用SPSS 20.0软件独立样本t-检验结果，判断两种方法各个测量参数平均值差异的显著性.

2 结果

2.1 DPI染法条件的优化

2.1.1 DPI染法的步骤

DPI染法显示NOR原始程序包括老化 (A)、甲酰胺处理 (FA)、烘片 (B)和PI染色等4个步骤.缺失或更换其中一个步骤对NOR差别显示结果的影响如表2所示.程序1将PI染色体更换为DAPI染色，程序3缺失甲酰胺处理步骤，得到的间期及中期染色体都被均匀染色，未能差别显示出NOR，表明甲酰胺处理和PI染色是必须步骤.程序2和程序4分别缺失烘片和老化步骤，间期及中期染色体仍然显示出高亮的NOR，表明烘片和老化为非必须步骤.

表2 缺失或更换步骤对DPI染法差别显示结果的影响Tab.2 The effect of deletion or replacement of a step in the procedure of DPI staining

2.1.2 甲酰胺处理的适宜条件

甲酰胺处理正交试验结果如表3所示.根据显示出NORs的间期核比例来检测不同甲酰胺处理条件对显带效果的影响.试验范围内，对显带效果影响最大的是处理时间，极差为12.33%;其次是甲酰胺浓度，极差为8.00%;第三是温度，极差为6.00%.处理时间中，4 min组显示比例最高，平均为67.67%，随着变性时间延长NORs显带比例反而下降.变性温度中，65℃组显示比例最高，平均为65.34%.甲酰胺浓度中，80%组显示比例最高，平均为67.67%.三个试验因素不同水平间平均值的差异均未达到显著水平.综上，DPI染法显示黄姑鱼NORs程序中，甲酰胺处理的适宜条件为:65℃，在预热的体积分数为80%的甲酰胺中处理4 min.

表3 甲酰胺处理影响因素正交试验设计与结果Tab．3 The design and results of orthogonal experimental of FA treatment

2.1.3 烘片温度和时间对DPI染法显带的影响

烘片温度和时间对DPI染法显带的影响如图1所示.60～80℃ 烘片5～20 min各组的Rnn均显著高于未经烘片的对照组，而16个烘片条件的Rnn之间没有显著性差异.但是，烘片时间过长或温度过高，会导致间期核荧光强度下降，甚至几近消失.综合Rnn和间期核视觉效果，本文采用60℃烤5～10 min，来提高NOR显示的对比度.

2.2 DPI染法与银染法的结果比较

2.2.1 差别显示的位置

DPI染法与银染法差别显示的位置如图2所示.图2a和图2b是同一中期相染色体，先用DPI染法处理，NOR显示为高亮区 (见图2a);然后顺序进行银染，NOR在同一位置显示为深染区 (见图2b).图2c和图2d是同视野下的间期核，分别是DPI染法和顺序银染的结果，同样表明DPI染法和银染法差别显示的位置是一致的.进一步比较图像还可以看出，DPI染法图像清晰，杂信号明显少于银染法.

图1 烘片的温度和时间对NORs与间期核荧光强度对比度的影响Fig.1 Effect of temperature and time of baking slides on the contrast of fluorescence intensity between NOR and nucleus

图2 DPI染法与银染法顺序染色在黄姑鱼中期染色体和间期核的差异显示区Fig.2 The differential display region on metaphase chromosomes and nuclei of yellow croaker by using DPI staining and silver staining

2.2.2 NOR显示数目

在DPI染法和银染法获得的显微图像中，随机各取400个间期核，统计每个间期核中NORs数目，作分布图如图3所示.DPI染法和银染法显示NOR，众数均为2.而NOR数目为1和2的比例，DPI染法 (49.05%和50.14%)略高于银染法(47.66%和48.83%).NOR数目为3的比例，银染法 (2.05%)高于DPI染法 (0.81%).此外，银染法处理组还观察到NOR数目大于3的细胞核，而DPI染法没有.

2.2.3 NOR的直径

DPI染法与银染法获得的显微图像中，随机取约200个间期核，测量NOR直径和相应的间期核直径，计算NOR与间期核的直径比，结果见表4.DPI染法显示的NOR直径略大于银染法，而间期核直径略小于银染法，但差异均未达到显著水平.

图3 DPI染法染色法与银染法显示间期核NORs个数分布Fig.3 Distribution of the number of NORs in a nucleus with DPI staining and silver staining

表4 染法与银染法显示间期核NOR的直径Tab．4 Diameter of NOR of interphase nucleus displayed by DPI staining and silver staining

3 讨论

1996年Rab等[7]发现热甲酰胺处理制片后再用PI染色，NOR区域可以差别显示为高亮区，证明了该方法至少可适用于15种鱼类，并将该法命名为DPI染法.本研究中，DPI染法和银染法的对比试验结果显示，DPI染法和银染法差别显示位置一致，数目分布相当，直径没有显著性差异.可见，DPI染法可以用于显示黄姑鱼NOR.综合研究结果，DPI染法显示黄姑鱼NOR的程序可以归纳为:制片在60℃恒温箱中老化3～6 h;转移到体积分数为80%的甲酰胺/2×SSC中65℃处理4min后，系列乙醇脱水;放在60℃电热板上烘片5～10 min;滴加含有1 μg/mL PI的封片剂，盖上盖玻片，指甲油封片.

热甲酰胺处理和PI染色是DPI染法的必须步骤.甲酰胺常用于降低退火温度，促进DNA的变性[13].Fernández等[14]发现，两种啮齿类动物和人类染色体制片经老化后，滴加体积分数为50%的甲酰胺水溶液，70℃ 变性2 min，再用Giemsa溶液染色，染色体会显示出C带带型 (组成型异染色质分布区域).Fernández等[14]认为，甲酰胺处理显示C带的原理是，DNA变性作用选择性破坏了常染色体的结构，影响了色素的结合.在鱼类中，热甲酰胺处理/PI染色可以显示出的NOR提示，这些鱼类的NOR分布可能与异染色质的分布相联系.事实上，在许多鱼类已发现NOR分布与组成型异染色质区域有联系，如玛红点鲑 (Salvelinus malma)、王鲑 (Oncorhynchus keta)[15]、虹鳟(Oncorhynchus mykiss)[16]、 热 内 罗 丽 脂 鲤 (Astyanax janeiroensis)[17]、 乔 氏 丽 脂 鲤 (A．fasciatus)[18]、南美牙鱼 (Hoplias malabaricus)[19]等.

PI是一种常用的核酸染料，可与单链或双链核酸分子的碱基相互作用，且对碱基没有选择[20].PI染中期染色体着色均匀.本研究尝试用DAPI取代PI，结果未能差别显示出NOR.这可能与DAPI染色存在碱基选择性有关.DAPI可与双链DNA相作用，在富含AT区域显示亮带，而在富含GC区域显示暗带[21-22].与其他区域相比，NOR区域通常富含GC[23]，常显示为DAPI阴性带.因此，可能由于DAPI染料对GC的副选择抵消了NOR/异染色质色素的强结合能力，将PI更换为DAPI即未能差别显示出黄姑鱼NOR.

本研究还发现制片染色前老化和染色后的烘片是非必须步骤，但对差别显示对比度均有明显改善作用.这可能是由于老化和烘片步骤可以变性蛋白质，减少了对DNA的位阻作用，从而突显了DNA信号.

根据王晓艳的研究结果[11]，二倍体黄姑鱼中期染色体上有2个NOR，因此间期核NOR数目预期为2.本研究中，DPI染色法和银染法显示间期核NOR的众数均为2，但也有大量的间期核只能观察到1个NOR(见图3).这可能与NOR的空间分布和核质的遮挡有关.DPI染色法中，还在个别间期核 (0.81%)中观察到3个高亮点，可能是偶然因素造成的赝像.银染法中，观察到3个以上差别显示点的比例远高于DPI法.这主要是由于银染法程序中，染色的终止依赖人眼的判断，容易过度染色，造成一些细小的银沉淀颗粒，干扰Ag-NOR计数[24].可见，DPI染色法比银染法具有更高的特异性.

综上所述，本文优化了DPI染法显示黄姑鱼NOR的条件，并比较了DPI染法与银染法差别显示的位置、数目和直径的差异.结果表明，DPI染法可以替代银染法用于显示黄姑鱼间期核和中期染色体的NOR.与银染法相比，DPI染法与银染法一样操作简单，不易产生假阳性的缺陷，并可与FISH联用，同时定位NOR和其他基因位点.本研究优化的程序可用于黄姑鱼群体染色体变异研究，也可为其他石首鱼科鱼类相关研究提供参考.

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