微流控芯片分析M4患者CD14+单核细胞中MPO表达*

宋敬敬 李晓亮 兰 杰 孙 朝 葛 鹏 洪程程 孙续国

·临床研究与应用·

微流控芯片分析M4患者CD14+单核细胞中MPO表达*

宋敬敬①李晓亮①兰 杰①孙 朝②葛 鹏③洪程程①孙续国①

目的：建立基于微流控细胞芯片技术分析CD14+单核细胞髓过氧化物酶（Myeloperoxidase，MPO）的方法，初步探讨急性粒-单核细胞白血病（M4）患者CD14+单核细胞的MPO表达。方法：以聚二甲基硅氧烷（PDMS）为基质材料，二次模塑成型工艺制备微流控细胞芯片。选取临床诊断M4患者48例，骨髓象大致正常患者52例作为对照组。设定微流控芯片检测单核细胞MPO方法，测定细胞MPO阳性率和程度。应用微流控细胞芯片法分析M4患者和对照组CD14+单核细胞的MPO表达。结果：设计微流控单细胞分析芯片，粒细胞能够进入相应微流控通道，可分离血细胞，但是白细胞周围存在影形细胞现象，而细胞形态未见有明显改变。M4患者骨髓细胞CD14+单核细胞MPO阳性率和活性明显高于对照组（P＜0.05）。结论：应用微流控单细胞技术分析CD14+单核细胞MPO表达，结果显示M4患者CD14+单核细胞MPO活性明显高于对照组，有可能作为辅助检查标志物。

单细胞分析 白血病 髓过氧化物酶 微流控芯片

1Medical Laboratory of Tianjin Medical University,Tianjin 300203,China;2Institute of Testing Instrument and Technology of

Tianjin Beiyang Medicine,Tianjin 300381,China;3Clinical Laboratory of Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospi

tal,Tianjin 300060,China

This work was supported by the High Level Innovation Fund(No.DL20121120),and Innovation Fund for Small and Medium

Sized Enterprises of Science and Technology

粒-单核细胞白血病（acute myelomonocytic leukemia，AMML/M4）患者骨髓与末梢血细胞中均出现幼稚单核细胞比例增多，并且细胞形态学出现大小不等、形态不规则变化。细胞出现白血病变化后可导致其与正常细胞在形态学上难以辨认［1］。临床检查中多利用细胞髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）染色、流式细胞术检测细胞标记等辅助检查粒细胞系与单核细胞系，为诊断M4提供实验支持［2-4］。细胞抗原表达的研究发现，细胞的成熟表现为细胞表面抗原的类型和数量随时间变化［5-6］，现发现的CD抗原已达一百多种，其中单核细胞多数表达CD14［7］，为研究细胞表达生物信息奠定基础。

粒细胞与单核细胞之间鉴别的主要生物标志物为MPO［8］。根据报道，检查细胞MPO活性的方法有细胞形态学MPO化学染色、免疫组织化学法、流式细胞术等［9］，这些方法可以分析细胞内酶活性，但是不能同时鉴定特定细胞内MPO活性。

大量研究表明白血病患者个体个体化信息，对于诊断和治疗效果密切相关［10-11］。由于白血病变化主要体现在单个细胞的变化，单细胞分析适合研究血液病的个体化信息，但是缺少一种能够识别细胞，同时实现单细胞分析标志物信息的技术。有报道利用毛细管电泳-单细胞分析MPO活性［12］，这种方法是微量和快速测定细胞内MPO的有效方法，但是在粒-单核细胞白血病患者诊断中需要鉴别幼稚粒细胞与单核细胞，单纯测定单细胞内活性，不能测定特定细胞内MPO的个体化信息。先前本组自行设计检测尿细胞微流控芯片，实现测定细胞信息功能［13］，为单细胞分析细胞表达CD14和MPO活性奠定基础。本研究建立微流控细胞分析芯片方法，并分析粒-单核细胞白血病患者单核细胞共表达CD14和MPO生物信息。

1 材料与方法

1.1 临床资料

选取天津医科大学肿瘤医院及天津市血液病研究所2013年3月至12月临床诊断粒-单核细胞白血病患者48例为患者组，临床诊断骨髓象大致正常患者52例为对照组。采集骨髓200 μL，末梢血300 μL用于微流控-单细胞分析芯片测定单核细胞共表达CD14和MPO、MPO染色、免疫组织化学细胞染色。

1.2 方法

1.2.1 微流控芯片雕刻 以聚二甲基硅氧烷（PDMS）为原始材料，PDMS与固化剂混合比例为10：1，浇注成设计形状，90℃条件下固化30 min，再进一步进行二次模塑成型工艺，制备细胞微流控芯片。

1.2.2 骨髓瑞氏染色 选择骨髓取材满意、涂片制备良好的骨髓片，要求细胞分布均匀，整体呈头体尾分布，加瑞氏染液Ⅰ液（Baso公司）染色1 min，加10 mmol/L PBS缓冲液200 μL，染色10 min，油镜观察细胞形态。

1.2.3 联苯胺法血细胞MPO染色 制备血细胞涂片经乙醇固定2 min后，滴加联苯胺-乙醇-亚硝基铁氰化钠溶液200 μL，27℃作用1 min，加入1：200稀释的1% H2O2100 μL，27℃作用5 min，利用瑞氏染液进行染色，显微镜观察细胞。

1.2.4 免疫组织化学染色 血涂片经乙醇固定2 min，加鼠源性CD14单克隆抗体（Abcam公司）200 μL，4℃避光反应2 h，PBS洗5次后加入1：100稀释的罗丹明标记羊抗鼠荧光二抗（中杉金桥公司）200 μL，4℃避光反应1 h，PBS洗5次后加入5 μmol/L DAPI（索莱宝公司）200 μL，避光反应5 min，PBS洗5次，显微镜下观察计数。

1.2.5 微流控芯片检测 制备细胞悬液，经过MPO染色后通过微流控制通道a进入芯片，调控试剂通过微流控通道b进入芯片系统，调控微流控比例和细胞分离流体，分析单核细胞表达CD14和MPO。

1.3 统计学分析

数据全部采用SPSS 17.0统计软件进行分析。对照组与M4患者MPO阳性率组间比较采用两样本均数t检验，MPO在各阶段表达差异比较采用卡方检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 微流控单细胞芯片分析系统

二次成型技术制造微流控细胞分析芯片包括标本进样微流控通道a、MPO染液微流控通道b，3个收集通道c、d和e。在微流控通道a和b能够调节进入微流控芯片的样本量（图1），实现单细胞分析表达CD14+单核细胞的MPO活性。

2.2 联苯胺法与微流控芯片法测定细胞MPO的表达

所有患者及对照组患者的造血细胞进行传统联苯胺染色，分析外周血白细胞MPO表达情况，结果粒细胞和单核细胞MPO染色均出现MPO阳性，但程度存在差异，粒细胞阳性程度介于+-至+++，单核细胞呈阴性或弱阳性反应，淋巴细胞呈阴性（图2）。微流控细胞芯片检测，粒细胞阳性程度亦介于+-至+++，计算1 000个细胞中MPO阳性率未见有明显差异（P＞0.05），MPO阳性程度未见显著性差异。在形态学上传统染色可见MPO阳性细胞周围有红细胞散在分布和集聚，而微流控芯片检查，MPO阳性细胞均可见聚集的其他影形细胞和细胞阴影，细胞形态未见有其他不规则变化（图3，表1）。

2.3 微流控单细胞芯片法分析CD14+单核细胞MPO的表达

荧光标记抗体染色计数CD14+单核细胞占总单核细胞比例，M4患者（81.59±7.47）%，正常对照组（80.08±6.60）%，两者比较未见统计学差异。利用微流控细胞芯片分别检测M4患者及对照组CD14+单核细胞的MPO表达，根据单核细胞MPO与底物的反应程度，本组将其划分为0～5级，分别比较MPO的阳性率和反应程度。结果显示两组幼稚阶段和成熟阶段细胞的MPO表达均有显著性差异（表2）。

▶A：Blood cells；B：Integral structure of the microfluidic cell-chip；（a to e）：Microchannel of the chip；C：Chip diagram of the separation principle；D：Separation of hematopoietic cells by using a charge-coupled device acquisition chip图1 微流控单细胞分析芯片分析系统（× 200）Figure 1 Microfluidic cell-chip analysis system

图2 比较M4组与对照组外周血白细胞MPO表达情况（联苯胺法×1 000）Figure 2 Comparison of leukocyte MPO expression in peripheral blood between the M4 group and the control group（benzidine test×1 000）

图3 比较微流控-单细胞芯片采集细胞信号与经典细胞形态学特点（×1 000）Figure 3 Comparison of cell signals collected by microfluidic cell-chip method with classical cell morphological characteristics

表1 比较联苯胺法与微流控芯片法检测细胞MPO表达Table 1 MPO expression obtained by microfluidic chip and benzidine methods

表2 分析CD14+单核细胞的MPO表达Table 2 Analysis of MPO expression in CD14+monocytes

3 讨论

急性粒-单核细胞白血病患者造血细胞系统中存在幼稚粒细胞和幼稚单核细胞增多现象，准确检测幼稚粒细胞和幼稚单核细胞是诊断M4的基础。由于幼稚粒细胞与幼稚单核细胞存在形态学相近的特点，在鉴别细胞时还需要检测MPO等其他生物标志物，用于辅助形态学检查。传统检测细胞MPO技术仅能定性，与细胞形态比较综合分析辅助鉴别粒细胞和单核细胞。流式细胞术在分析细胞表达抗原方面具有高通量、快速、多参数分析等优点，已经被广泛应用［14］，但仅局限于细胞标志物检测，而难以对特定类型细胞的表达蛋白进行分析［15］。为综合分析特定细胞形态与生物标志物活性，本组设计一种能够采集细胞图像信息的单细胞分析微流控芯片系统，包括细胞筛选的微流控细胞芯片、微流控调控器，能够单细胞分析单核细胞表达的特定生物信息信号。

临床确诊粒-单核细胞白血病后，经过治疗患者造血细胞形态变化明显，造成细胞形态更加难以辨别，结果未显示。分析M4患者血细胞中是否存在幼稚粒细胞和幼稚单核细胞，MPO阳性细胞比例为（72.40±5.48）%，表达MPO活性从-至+。而表达CD14细胞比例为（81.59±7.47）%。传统技术能单项检测细胞MPO或CD14表达，难以实现综合测定单核细胞表达CD14细胞的MPO活性。

为实现微流控细胞芯片单细胞分析表达CD14+单核细胞MPO活性，以联苯胺法作为对照组比较联苯胺法与微流控芯片法两种方法同时分析患者组和对照组白血病细胞MPO阳性率，结果显示设计微流控芯片分析法与联苯胺法相关（PM4=0.12，Pcontrol= 0.53）。进一步观察发现联苯胺法MPO阳性细胞周围存在红细胞，也可见发生重叠集聚现象，而微流控细胞芯片检测未见重叠集聚细胞，但可发现细胞残渣散在和集聚存在，甚至包绕白血病细胞，提示芯片分析系统具有优势。

利用微流控细胞芯片技术测定CD14+单核细胞MPO表达量存在差异，根据表达量划分为0～5级。比较对照组与M4患者成熟单核细胞及幼稚单核细胞MPO表达程度，结果M4患者幼稚单核细胞MPO表达程度明显高于对照组，成熟细胞MPO表达程度，M4患者组明显高于对照组。

本试验首次报道一种基于微流控细胞芯片技术分析双重标记单核细胞CD14和MPO表达的方法，研究结果显示M4患者CD14+的单核细胞MPO阳性程度明显高于正常，有可能作为辅助检查单核细胞白血病的标志物。

1 Liu Y,Tang XF,Shen JL,et al.Morphologic Diagnosis and Onset Characteristics of Acute Leukemia：A Retrospective Analysis of 233 Cases in 10 Years[J].Journal of Experimental Hematology 2012,20 (4)：823-828.[刘 毅,唐湘凤,沈建良,等.急性白血病形态学诊断及其发病特点—233例患者的10年回顾性分析[J].中国实验血液学杂志,2012,20(4)：823-828.]

2 Rollins-Raval MA,Roth CG.The value of immunohistochemistry for CD14,CD123,CD33,myeloperoxidase and CD68R in the diagnosis of acute and chronic myelomonocytic leukaemias[J].Histopathology,2012,60(6)：933-942.

3 Zhang JH,Wang YX,Wang HT.Characteristics of Panmyelosis：A Report of 5 Cases[J].Chinese Journal of Clinical Oncology, 2009,36(5)：245-248.[张继红,王韫秀,王洪涛.全髓白血病特点分析(附5例病例报告)[J].中国肿瘤临床,2009,36(5)：245-248.]

4 Klco JM,Kulkarni S,Kreisel FH,et al.Immunohistochemical analysis of monocytic leukemias：usefulness of CD14 and Kruppel-like factor 4,a novel monocyte marker[J].Am J Clin Pathol,2011,135 (5)：720-730.

5 Wang YX,Zhang JH,Hu YP,et al.Significance and Application Value of Multiparameter Flow Cytometry for Differentiation of Immunophenotype in Chronic Myelomonocytic Leukemia,Myelodysplastic Syndrome and Acute Monocytic Leukemia[J].Journal of Experimental Hematology 2012,20(4)：857-862.[王韫秀,张继红,胡延平,等.多参数流式细胞术在慢性粒单核细胞白血病、骨髓增生异常综合症及急性单核细胞白血病免疫表型鉴别中的应用及其意义[J].中国实验血液学杂志,2012,20(4)：857-862.]

6 Lu D,Liu YR.Research Advances in Value of Flow Cytometric Immunophenotyping in Diagnosis and prognositic Evaluation of Myelodysplastic Syndrome[J].Journal of Experimental Hematology 2013,21(3)：785-790.[卢 丹,刘艳荣.免疫分型在骨髓增生异常综合征的诊断和预后判断中的作用研究进展[J].中国实验血液学杂志,2013,21(3)：785-790.]

7 Wang X,Xia YQ,Zhang K.The significance of CD64 and CD14 expression in differential diagnosis of monocyte lineage inyolved leukemia[J].Int J Lab Med,2013,34(2)：158-159.[王 贤,夏永泉,张 葵.CD64和CD14单核细胞相关性急性髓系白血病诊断中的意义[J].国际检验医学杂志,2013,34(2)：158-159.]

8 Choi Y,Lee JH,Kim SD,et al.Prognostic implications of CD14 positivity in acute myeloid leukemia arising from myelodysplastic syndrome[J].Int J Hematol,2013,97(2)：246-255.

9 Chong HF,Ding TL,Wu BQ,et al.Detection of cytoplasmic antigen MPO by f low cytometry[J].Lab Med Clin,2011,8(6)：657-658.[崇慧峰,丁天凌,吴蓓倩,等.流式细胞仪检测白细胞髓过氧化物酶的方法研究[J].检验医学与临床,2011,8(6)：657-658.]

10 Diamandis M,White NM,Yousef GM.Personalized medicine：marking a new epoch in cancer patient management[J].Mol Cancer Res,2010,8(9)：1175-1187.

11 Cagnetta A,Adamia S,Acharya C,et al.Role of genotype-based approach in the clinical management of adult acute myeloid leukemia with normal cytogenetics[J].Leuk Res,2014,38(6)：649-659.

12 Wang YJ,Chen XL,Li H.The expression of myeloperoxidase in acute leukemia by electrophoresis[J].China PracMed,2007,2(10)：11-13.[王永静,陈学良,李 颢.毛细管电泳法检测髓过氧化物酶在急性白血病中的表达[J].中国实用医药,2007,2(10)：11-13.]

13 Sun GX,Ge P,Song JJ,et al.A Research of the Microfluidic Cell Chip Technology to Reduce Urine Cells Overlap Rate[J].Applied Mechanics and Materials,2014,440：121-126.

14 Chen X,Wang YW.The Application Progress of Flow Cytometry in Medical Laboratory[J].Medical Recapitulate,2012,18(22)：3822-3824.[陈 鑫,王延伟.流式细胞技术在医学检验中的应用研究进展[J].医学综述,2012,18(22)：3822-3824.]

15 Wang HF,Li YX.The value of blood smear review test in the reliability of result by instrument test[J].Int J Lab Med,2010,31(3)：222-223.[高海峰,李云霞.血涂片复检在采用仪器法测定结果可靠性评估中的价值[J].国际检验医学杂志,2010,31(3)：222-223.]

（2014-04-06收稿）

（2014-05-10修回）

（本文编辑：郑莉）

Microfluidic cell chip method to analyze CD14+monocyte myeloperoxidase expression in acute myelomonocytic leukemia patients

Jingjing SONG1,Xiaoliang LI1,Jie LAN1,Chao SUN2,Peng GE3,Chengcheng HONG1,Xuguo SUN1
Correspordence to:Xuguo SUN;E-mail:sunxuguo@tijmu.edu.com

Objective:A method that is based on microfluidic cell chip technology was developed for the first time to analyze CD14+monocyte myeloperoxidase(MPO)expression in myelomonocytic leukemia(M4)patients.CD14+monocyte MPO expression in M4 patients was preliminarily discussed.Methods:a.The chip was prepared by using polydimethylsiloxane as the host material and by secondary foam molding.b.A total of 48 clinically diagnosed M4 patients and 52 patients with normal myelogram were included as the test and control groups,respectively.c.A method based on the microfluidic cell chip approach was established to detect CD14+monocytes and to determine the positive rate and degree of MPO expression in the cells.d.The microfluidic cell chip technique was used to compare CD14+monocyte MPO expression in M4 patients with that in the control.Results:a.The designed microfluidic single cell analysis chip allowed the entry of granulocytes into the corresponding microfluidic channels.Thus,blood cells were separated.Numerous ghost corpuscles surrounded the separated white blood cells(WBCs).WBC morphology did not show obvious changes.b.The positive rate of MPO expression and the activity of CD14+monocytes in the bone marrow of M4 patients were significantly higher than those in the bone marrow of the control(P＜0.05).Conclusion:A method based on microfluidic single cell technology was developed for the first time to analyze the MPO expression in CD14+monocytes.CD14+monocyte MPO activity in M4 patients was significantly higher than in the control.CD14+monocyte MPO activity can be used as an auxiliary examination marker for clinical diagnosis.

single-cell analysis,leukemia,myeloperoxidase,microfluidic chip

10.3969/j.issn.1000-8179.20140569

宋敬敬 硕士研究生。研究方向为微流控芯片在医学检测中的应用。

①天津医科大学医学检验学院（天津市300203）；②天津市北洋医学检测仪器与技术研究所；③天津医科大学肿瘤医院检验科

*本文课题受国家科技型中小企业创新基金（编号：DL20121120）资助

孙续国 sunxuguo@tijmu.edu.com

E-mail：sife512@163.com