呼吸道感染患儿血清Toll样受体、Dectin及CD14测定临床意义

罗丽丹王鑫华童夏生冯利平王恩智

1浙江省温岭市第四人民医院儿科 台州 317523 2浙江省台州市中西医结合医院

呼吸道感染患儿血清Toll样受体、Dectin及CD14测定临床意义

罗丽丹1王鑫华2童夏生2冯利平2王恩智2

1浙江省温岭市第四人民医院儿科 台州 317523 2浙江省台州市中西医结合医院

呼吸道感染；儿童；Toll样受体；Dectin；CD14；临床意义

机体免疫系统对感染的识别及应答依赖于模式识别受体，Toll样受体（TLR）被认为是最主要的模式识别受体[1]，参与感染、哮喘、肿瘤等疾病的炎症过程。最近研究发现TLR2、6与Dectin、膜蛋白细胞分化抗原14（CD14）等模式识别受体具有协同作用，共同对微生物和外源性分子等产生免疫应答，它们通过髓样分化因子（MyD88）/NF-κB途经产生TNFα、IL-12等炎症因子起到相互增强作用[2]。本研究检测毛细支气管炎和急性上呼吸道感染患儿血清模式识别受体TLR2、Dectin及可溶性CD14（sCD14）的表达，以了解血清模式识别受体在儿童呼吸道感染中的发病机制，报道如下。

1 临床资料

选取2011年10月—2012年8月本院住院患儿118例，其中毛细支气管炎[3]53例，男31例，女22例；年龄0.3～4岁，平均（1.9±0.9）岁；急性上呼吸道感染[3]65例，男39例，女26例；年龄0.5～4岁，平均（2.1±1.0）岁；病程均＜48h。并取30名门诊健康体检儿童为健康对照组，男17名，女13名；年龄0.41～4岁，平均（2.0±1.1）岁。三组年龄、性别比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。

2 方法

采集患儿入院当天静脉血2mL，对照组门诊体检时采集。静置2h后3000r/min离心15min，分离血清，-80℃冰箱贮存，集中检测。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）法，检测血清TLR2、Dectin及sCD14的蛋白浓度，试剂盒均购自上海研吉生物科技有限公司。

测定方法：试剂盒平衡于室温20～25℃待用，取96孔反应板，加入40μL标品于反应孔里，然后再加生物素标记的TLR2、Dectin及sCD14抗体各10μL，轻轻晃动混匀。用封板膜封板后置37℃温育30min，洗涤液用蒸馏水30倍稀释后洗涤5次，每孔加入酶标试剂50μL，再经温育、洗涤，每孔先加入显色剂A 50μL，再加入显色剂B50μL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15min，每孔加终止液50μL终止反应，以空白空调零，全自动酶标仪（芬兰Labsystems Dragon公司）450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值），绘制标准曲线，根据各标本吸光度值在标准曲线上查得相应浓度。

统计学方法：应用SPSS16.0统计软件进行统计分析，数据以均数±标准差（） 表示，采用F检验、t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

毛细支气管炎组和急性上呼吸道感染组血清TLR2、Dectin及sCD14蛋白浓度均显著高于健康对照组（P＜0.01）；毛细支气管炎组血清Dectin蛋白浓度显著高于急性上呼吸道感染组（P＜0.01），两组血清TLR2和sCD14差异无统计学意义（P均＞0.05），见表1。

表1 三组血清TLR2、Dectin及sCD14比较（） ng/mL

表1 三组血清TLR2、Dectin及sCD14比较（） ng/mL

注：与健康对照组比较，*P＜0.01；与急性上呼吸道感染组比较，△P＜0.01

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4 讨论

天然免疫是机体识别和清除外源性病原体的主要途经，是环境暴露和调节细胞因子应答的重要环节。急性上呼吸道感染和毛细支气管炎是儿童最为常见的急性感染性疾病，主要由呼吸道合胞病毒、流感病毒、副流感病毒等感染引起，继而机体出现炎症反应[4]。

介导天然免疫的主要模式识别受体包括TLR、Dectin、CD14、核苷酸寡聚化域样受体和维A酸诱导基因Ⅰ样受体等。TLR属于Ⅰ型跨膜蛋白，表达于细胞表面或细胞内，通过胞外区的亮氨酸的重复序列，特异性识别病毒，并启动细胞内信号转导通路，产生免疫应答，发挥抗病毒作用，它还与其它模式识别受体之间具有相互协同作用。Dectin是一个包涵细胞外C型凝集素样碳水化合物识别域的糖基化的Ⅱ型跨膜受体，主要表达于单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞上，通过这些细胞的吞噬作用达到清除病原体的目的，并产生大量的炎症因子和细胞因子。还能通过β-葡聚糖和非β-葡聚糖依赖性方式与T细胞相互作用，促进Th1/Th17细胞的活化及Treg细胞的免疫应答，产生免疫记忆[5]。不仅在支气管上皮细胞的真菌感染中起重要作用[6]，还能使肺泡巨噬细胞对H1N1流感病毒A型产生天然免疫应答，产生大量的干扰素、炎症因子和趋化因子[7]。CD14表达于单核细胞、巨噬细胞和中性粒细胞上，有膜结合型（mCD14）和可溶性两种形式。CD14和脂多糖、脂多糖结合蛋白一起形成一种复合体，与细胞膜上Toll样受体结合，介导机体细菌或病毒感染的天然免疫过程。在巨噬细胞介导的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌肺炎和坏死性肺炎的天然免疫反应中，潘顿-瓦伦丁杀白细胞素是通过TLR2、CD14、MyD88、白介素1受体相关激酶、肿瘤坏死因子受体相关因子6依赖的方式产生免疫反应[8]。在HIV-2感染的患者中，血清sCD14的浓度升高与病情危重程度有关，还与高敏C反应蛋白及IL-6等生物标记物呈正相关，认为它是一个能预测病情的炎症标记物[9]。在呼吸道合胞病毒感染的毛细支气管炎患者中，血清sCD14的浓度与病情的进展有关，其程度受基因多态性影响[10]，还与喘鸣的发作次数有关，有喘鸣再次发作的患者低于不再喘息发作的患者，提示它倾向于Th1发展趋势[11]。本研究发现，血清TLR2、Dectin、sCD14的蛋白浓度在毛细支气管炎组及急性上呼吸道感染组中升高，提示它们共同参与呼吸道感染的天然免疫应答；同时还发现毛细支气管炎组血清Dectin蛋白浓度高于急性上呼吸道感染组，而TLR2和sCD14的蛋白浓度无差异，提示Dectin的反应可能因病而异，对判断疾病或许有一定的参考价值，而TLR2和sCD14对病毒的应答可能没有选择性差异。相似的研究发现，在上呼吸道感染小鼠模型中发现，肺组织TLR3的表达升高，而在恢复期降到正常水平[12]，进一步提示TLR在上呼吸道感染的免疫反应中也起了一定的作用。

综上所述，毛细支气管炎及急性上呼吸道感染患儿血清TLR2、Dectin、sCD14浓度升高（P＜0.01），提示在呼吸道感染急性期模式识别受体被激活，从而提升机体清除病原体的能力。检测患儿模式识别受体的表达，为毛细支气管炎及急性上呼吸道感染发病机制的研究提供了理论依据，为判断病情提供参考价值。

参考文献

［1］Wei L，Jiao P，Yuan R，et al.Goose Toll-like receptor 7（TLR7），myeloid differentiation factor 88（MyD88）and antiviral molecules involved in anti-H5N1 highly pathogenic avian influenza virus response［J］.Vet Immunol Immunopathol，2013，153（1-2）：99-106.

［2］Dennehy KM，Willment JA，Williams DL，et al.Reciprocal regulation of IL-23 and IL-12 following co-activation of Dectin-1 and TLR signaling pathways［J］.Eur J Immunol，2009，39（5）：1379-1386.

［3］胡亚美，江载芳.诸福棠实用儿科学［M］.第7版.北京：人民卫生出版社，2002：1199-1201.

［4］李晨虹，童夏生，罗冬娇，等.肿瘤坏死因子-α及其受体在急性毛细支气管炎患者血清中的表达［J］.中国妇幼保健，2011，26（8）：1210-1212.

［5］Carvalho A，Giovannini G，De Luca A，et al.Dectin-1 isoforms contribute to distinct Th1/Th17 cell activation in mucosal candidiasis［J］.Cell Mol Immunol，2012，9（3）：276-286.

［6］Sun WK，Lu X，Li X，et al.Dectin-1 is inducible and plays a crucial role in Aspergillus-induced innate immune responses in human bronchial epithelial cells［J］.Eur J Clin Microbiol Infect Dis，2012，31（10）：2755-2764.

［7］Jieru Wang，Mrinalini P.Nikrad，Emily A.Travanty，et al.Innate Immune Response of Human Alveolar Macrophages during Influenza a Infection［J］.PLoS One，2012，7（3）：e29879.

［8］Zivkovic A，Sharif O，Stich K，et al.TLR 2 and CD14 mediate innate immunity and lung inflammation to staphylococcal Panton-Valentine leukocidin in vivo［J］.J Immunol，2011，186（3）：1608-1617.

［9］Thiébaut R，Charpentier C，Damond F，et al.Association of soluble CD14 and inflammatory biomarkers with HIV-2 disease progression［J］.Clin Infect Dis，2012，55（10）：1417-1425.

［10］Inoue Y，Shimojo N，Suzuki Y，et al.CD14-550 C/T，which is related to the serum level of soluble CD14,is associated with the development of respiratory syncytial virus bronchiolitis in the Japanese population［J］.J Infect Dis，2007，195（11）：1618-1624.

［11］Soferman R，BarZohar D，Jurgenson U，et al.Soluble CD14 as a predictor of subsequent development of recurrent wheezing in hospitalized young children with respiratory syncytial virus-induced bronchiolitis［J］.Ann Allergy Asthma Immunol，2004，92（5）：545-548.

［12］郑艳，耿连艺，盛夏，等.上感颗粒对病毒性上呼吸道感染小鼠肺组织TLR3及PKR mRNA表达的影响［J］.南京医科大学学报（自然科学版），2011，31（3）：410-413.

2013-08-06

修回日期：2013-12-16

浙江省温岭市科技局基金资助项目（No.2011-1-85）

通迅作者：童夏生，E-mail：xshtzg@163.com