活血生肌中药外用对大鼠失神经支配创面角蛋白19表达的影响

董黎强成信法尹 航王昌兴胡伟锋

1浙江中医药大学附属第二医院骨一科 杭州 310053 2浙江中医药大学

活血生肌中药外用对大鼠失神经支配创面角蛋白19表达的影响

董黎强1成信法2尹 航1王昌兴1胡伟锋1

1浙江中医药大学附属第二医院骨一科 杭州 310053 2浙江中医药大学

目的观察活血生肌外用中药对大鼠失神经支配创面角蛋白19（k19）阳性表达的影响。方法168只SD大鼠随机分成龙血膏组、生肌膏组、失神经组和正常组，每组42只。对前三组大鼠制造背部失神经支配的深创面模型，之后各组创面分别以龙血生肌膏、生肌愈皮膏、凡士林外用治疗；正常组大鼠背部制造深创面模型，以凡士林治疗。观察不同时间点各组创面愈合率、创面组织k19阳性表达率。结果各时间点正常组两中药组创面愈合率均高于失神经组（P＜0.05，P＜0.01）。龙血膏组、生肌膏组k19阳性表达于第11天达峰值，失神经组和正常组第15天达峰值。第4、7、11、15天时龙血膏组、生肌膏组k19阳性表达率明显高于失神经组和正常组（P＜0.05，P＜0.01），失神经组低于正常组（P＜0.05，P＜0.01）。结论活血生肌外用中药对失神经支配创面的愈合有促进作用，可能与外用中药增强了失神经支配创面的表皮干细胞增殖与分化有关。

大鼠；创面；去神经支配；生肌愈皮膏；龙血生肌膏；角蛋白19

截瘫后肢体创面、压力性及糖尿病性溃疡多伴有创面范围神经支配的缺失或障碍[1]，失神经支配的创面愈合较困难[2]。研究认为，创面愈合与表皮干细胞（ESCs）的增殖、分化关系紧密[3]，神经纤维物质对表皮干细胞的调控发挥着重要作用[4]，而伴有神经受损创面的愈合困难可能与这种调控的缺失密切相关[5]。鉴于表皮干细胞在创面修复中的重要作用，本课题以表皮干细胞表面标记物角蛋白19（K19）为主要观测指标，探讨活血生肌外用中药干预失神经支配创面愈合的作用机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 SD大鼠168只，体质量220～250g，由浙江中医药大学动物实验中心提供，实验动物合格证号：SYXK（浙）2003-0003。

1.2实验药物 生肌愈皮膏（药物组成：乳香、没药、当归、甘草、白芷、杏仁，济南恒基制药有限公司生产，批准文号：B20021045）。龙血生肌膏（药物组成：地龙、血竭、生大黄、黄柏、乳香、没药、白及等，由浙江中医药大学附属第二医院配制）。

1.3动物模型制作 168只大鼠随机分为龙血膏组、生肌膏组、失神经组和正常组，每组42只。参照文献制造失神经支配的深创面模型[1]：取大鼠背部为手术部位，除正常组外，其余三组以0.3%戊巴比妥钠按10mL/kg剂量腹腔注射麻醉后先离断T11～13、L1～2脊神经。继而四组均以自制直径1.5cm的环形纸板在大鼠脊柱右侧旁开1cm外皮肤上作标记，消毒后剪除直径1.5cm的圆形皮肤，再以直径1.5cm、深度2mm的自制金属环锯在相应皮肤缺损区域肌肉上作环形切割，并以手术刀片去除该区域内深度2mm的肌肉组织。术后龙血膏组、生肌膏组大鼠创面分别以龙血生肌膏、生肌愈皮膏各1g外用；失神经组和正常组创面以凡士林外用。均以纱布包扎创面，每天定时换药1次。每只大鼠均单笼喂养，并自由饮水、进食。

1.4检测指标 ①创面愈合率：造模后1、4、7、11、15、21、28天各组处死大鼠各6只，以数码照相机等距离拍摄创面，将创面图像扫入计算机，Image Pro Plus6.0软件算出创面面积，再算出创面愈合指数，并测算创面愈合率[6]。②创面K19测定及观察：不同时间点各组大鼠创面组织样本进行K19的免疫组织化学染色，光镜下观察K19的表达情况，K19阳性细胞呈现为细胞胞核复染为蓝色，细胞浆为棕黄色，胞膜无着色。用Image pro plus6.0图像分析系统分析软件，测定距离创面中心0.6cm范围内的表皮及真皮K19表达阳性信号。每个标本阳性细胞数计数方法：任意选择20个400倍视野拍照，对每个视野内的100个细胞进行观察，记录该视野内阳性细胞数，测算阳性细胞率[7]。

1.5统计学方法 应用SPSS17.0统计软件。数据以均数±标准差（） 表示。对多组计量资料进行单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1各组创面愈合率比较 实验第4天始，各观察时间点失神经组创面愈合率明显低于两个中药组，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。正常组创面愈合率明显高于失神经组，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。各时间点两中药组间创面愈合率差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

2.2各组K19阳性细胞表达率比较 免疫组织化学染色结果，术后第1天，各组创面K19阳性表达均少，失神经组最低，与龙血膏组比较差异有统计学意义（P＜0.05），其余各组间差异无统计学意义（P＞0.05）。从造模后第4天起各组创面K19阳性细胞开始明显增加。第4、7、11、15天4个时间点两中药组K19阳性细胞率均高于失神经组，差异均有统计学意义（P＜0.01）；正常组第4、7、11、15天4个时间点K19阳性细胞率均高于失神经组，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）；两中药组第4、7、11、15天时间点K19阳性细胞率均高于正常组，差异均有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）；四组第21、28天K19阳性细胞率比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。两中药组K19阳性细胞率均于第11天达到峰值，而失神经组和正常组则延迟至第15天才达到峰值。各时间点龙血膏组K19阳性细胞率均稍高于生肌膏组，但差异均无统计学意义（P＞0.05），见表2。

3 讨论

研究提示，表皮生长因子（EGF）对于创面愈合的调控起着重要的作用，其机制主要是通过诱导表皮干细胞的增殖和分化从而达到加速受损表皮的再生[2]。同时研究表明[4]，神经因素与机体多种干细胞分化及迁移关系密切，表皮干细胞和感觉神经纤维在时空分布上具有一致性。伴有神经缺失或障碍的难愈合创面同时也存在着神经纤维物质对表皮干细胞调控的缺失[5]。因此，表皮干细胞目前已经成为一个创面愈合的重要观察指标，如何促进失神经支配创面表皮干细胞的增殖、分化是一个值得研究的课题。目前对于特异性的表皮干细胞表面标记物尚未统一认识,但对于如角蛋白15、19（K15、K19）和β1整合素等一些细胞表面糖蛋白，已被诸多学者加以关注[8]。研究指出[8]，K19被认为不仅仅是毛囊隆突处干细胞的表面标记物，也是表皮干细胞的表面标记物,对于表皮干细胞的鉴定及分选都有着重要的意义。因此，我们选用K19作为观察指标，通过检测K19的阳性表达反映表皮干细胞的含量变化，了解创面愈合的过程。

表1 各组创面愈合率比较（） %

表1 各组创面愈合率比较（） %

注：与失神经组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

表2 各组创面组织中K19阳性细胞率比较（） %

表2 各组创面组织中K19阳性细胞率比较（） %

注：与失神经组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

组别龙血膏组生肌膏组失神经组正常组创面/个6 6 6 6第1天11.22±1.24△10.53±1.33 9.13±1.58 10.31±1.19第4天24.30±1.11△△** 23.52±1.25△△** 13.35±1.67 16.21±1.52△第7天48.39±2.69△△** 46.88±2.77△△** 22.65±1.82 30.45±1.74△△第11天73.16±3.19△△** 71.54±3.25△△** 32.38±2.23 42.62±2.81△△第15天59.12±2.19△△** 57.85±2.08△△* 48.62±2.54 55.27±1.88△△第21天28.43±1.33 27.67±1.22 27.33±1.65 29.21±2.01第28天16.20±1.83 14.81±1.21 14.67±1.72 15.28±0.98

中医药对于创面治疗有着一套独特的理论系统，而且历史悠久，验效兼备。龙血生肌膏具有化瘀、清热、祛腐、生肌之功效，应用该药治疗诸多慢性难愈创面有较好疗效。从药物组方来看，龙血生肌膏与生肌愈皮膏方中皆有乳香、没药，两药膏均具活血生肌、消肿止痛之功效。生肌愈皮膏中的当归为补血活血之品，甘草为益气、清热解毒之药，杏仁苦辛疏泄，入气分。三味相伍补气血、清解之力强，兼具活血消肿之功。而龙血生肌膏中的地龙具有解毒、活血化瘀、生肌止痛和抑菌作用，《本草纲目》记载能治溃烂、口舌糜疮。血竭原名麒麟竭，曾被李时珍推祟为“活血圣药”，称其能“散瘀血诸痛”，可“治外伤出血不止……臁疮溃久不合”。并认为“乳香、没药虽主血病，而兼入气分，此则专于血分者也。”方中地龙、血竭、乳香、没药合用，则活血生肌、化瘀止痛之效更专；更佐以黄柏和生大黄清热燥湿，泻火逐瘀；白及收敛止血，消肿生肌。因此，龙血生肌膏和生肌愈皮膏均具有很好的化瘀、清热、祛腐、生肌之功效。

本研究发现，创面失神经支配后其愈合速度明显慢于正常创面，而外用龙血生肌膏与生肌愈皮膏对于失神经支配创面的愈合均有明显促进作用。失神经支配创面K19的阳性表达率，在创面愈合的中、后期阶段明显低于正常创面。而外用中药对于失神经支配创面K19的阳性表达有明显的促进作用，两中药组均提前了K19阳性表达的峰值。龙血生肌膏促进失神经支配创面K19阳性表达的作用略优于生肌愈皮膏，但两组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。上述结果提示，中药对失神经支配创面表皮干细胞增殖分化的调节作用比较突出。

因此，我们认为，外用愈创中药对于失神经支配创面的愈合有明显的促进作用，其机制可能与外用中药能有效增强创面表皮干细胞的增殖分化有关。失神经支配创面愈合过程复杂，影响因素众多；并且促进创面愈合的外用中药种类繁多，有效成分难以明确。本实验仅提供了从表皮干细胞着手研究外用中药促进失神经支配创面愈合作用机制的思路。对于外用中药对神经物质与表皮干细胞之间的相关性、细胞内外信号通路的影响等尚有待进一步研究。

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Effect of the External Use of Chinese Traditional Medicine on Keratin 19 of the Denervated Wound of Rats

DONG Liqiang1，CHENG Xinfa2，YIN Hang1，WANG Changxing1，HU Weifeng1.1 Second Hospital Affiliated to Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou(310053)，China；2 Zhejiang Chinese Medical University

ObjectiveTo investigate the effect of the external use of Chinese medicine on the expression of Keratin 19（K19）in denervated wound healing of rats.MethodsOne hundred and sixty-eight SD rats were randomly divided into 4 groups:A group（longxuegao group），B group（shengjigao group），C group（denervated group），and D group（normal group），42 rats in each group.A wound with denervated whole layer skin defection was established on the back of every rat in A，B，and C groups，while a wound with whole layer skin defection was established on the back of every rat in D group.The rat in A and B groups were externally treated with the corresponding drugs，and the rat in C and D groups were treated with vaseline.The healing rates of wound were calculated and the level of K19 expression was determined by immunohistochemistry at different time points after intervention.ResultsThe healing rate of A，B，and D groups were higher than that of C group（P＜0.05）.The level of K19 expression of A and B groups reached the peak on d11，which was earlier than that of C and D groups（on d15）.On d4，d7，d11，d15，the level of K19 expression of A and B groups was significantly higher than that of C and D groups（P＜0.05 or P＜0.01），and that of C group was lower than that of D group（P＜0.05 or P＜0.01）.ConclusionThe external use of Chinese medicine can promote wound healing of denervation.Its mechanism may be related to enhancing proliferation and differentiation of epidermal stem cells in the healing process of the wound of denervation.

rats；wound；denervation；shengjiyupigao；longxueshengjigao；keratin 19

2013-10-08

修回日期：2014-02-27

浙江省中医药科技计划项目（No.2009CA035）

董黎强，E-mail：dlq58@126.com，Tel：13867432797