5种柑橘病害叶片的FTIR鉴别研究

2014-07-02 10:56赵兴祥等

湖北农业科学 2014年6期

赵兴祥等

摘要：利用傅里叶变换红外光谱（FTIR）技术与统计分析相结合对柑橘褐斑病、黄龙病、溃疡病、煤烟病、芽枝孢霉斑病和正常的叶片进行研究。发现正常叶和病害叶的红外光谱很相似，导数光谱能够提高分辨率和放大差异，对光谱分别进行二阶导数分析，发现病害叶和正常叶的二阶导数光谱在1 200～700 cm-1范围内有明显的差异，选取该区的光谱数据进行相关性分析。结果显示，柑橘正常叶之间、同种病害叶之间的相关系数都在0.918以上，不同病害叶之间及不同病害叶与正常叶之间相关系数差异较大。选取1 200～700 cm-1范围内的原始光谱、一阶和二阶导数光谱分别进行主成分分析和聚类分析。所有样本用二阶导数光谱进行主成分分析的正确率为92.5%，比原始光谱和一阶导数光谱正确率高。原始光谱、一阶和二阶导数聚类分析正确率分别为52.5%、80.0%、90.0%。结果表明，傅里叶变换红外光谱技术能够快速、准确地检测区分这5种柑橘病害。

关键词：傅里叶变换红外光谱（FTIR）；柑橘病害；聚类分析；主成分分析

中图分类号：O657.3；S436.6 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）06-1304-04

Identifying Five Citrus Diseased Leaves by FTIR Spectroscopy

ZHAO Xing-xiang，LIU Gang，OU Quan-hong，HAO Jian-ming，ZHOU Xiang-ping，LI Wei-xing，WANG Xiao-hua

（School of Physics and Electronic Information， Yunnan Normal University， Kunming 650500， China）

Abstract： Citrus brown spot， citrus yellow shoot， canker， fuliginous， cercospora sp. and healthy leaves were analyzed by Fourier transform infrared spectroscopy（FTIR） combined with statistical analysis. The results showed that the spectra of samples were similar. Derivative spectra of FTIR can obviously enhance the spectral resolution and amplify small differences. The second derivative spectra were analyzed with obvious differences in the range of 1 200～700 cm-1. The correlative analysis showed that the correlation coefficients were more than 0.918 between healthy leaves， and between the same diseased leaves. The preprocessed original dataset， first derivative dataset and second derivative dataset in the range of 1 200～700 cm-1 were used to make the principal component analysis（PCA） and hierarchical cluster analysis（HCA）. The performance of the overall accuracy of PCA was 92.5%， better than original dataset and first derivative dataset. The cluster analysis accuracy of original spectra， first derivative and second derivative was 52.5%，80.0%，90.0%， respectively. It is indicated that FTIR spectroscopy can detect citrus diseases fast and accurately.

Key words： FTIR； citrus diseases； cluster analysis； principal component analysis

柑橘（Citrus sp.）在植物分类学上属芸香科（Rutaceae）柑橘亚科（Aurantioideae）柑橘族（Aurantieae）柑橘亚族（Citrinae），为世界性重要果树。其果实为全世界产量最大的水果。柑橘适合栽种在雨量较为充沛、气候温暖的地区，主要在亚洲、非洲和美洲种植[1]。柑橘富含类黄酮，已有研究表明，柑橘类黄酮具有抗氧化、抗病毒、抗癌活性、抗炎症，有预防动脉粥样硬化和胆固醇增加等作用，具有较高的药用价值[2]。

柑橘在植株生长发育和果实贮存、运输过程中受一些生物和非生物因素的影响，导致病害发生，造成柑橘产量和品质降低，严重影响柑橘产业的可持续发展。柑橘病害引起的经济损失在世界范围内受到关注，有些传染性病害目前还没有有效的解决办法[3]。在柑橘生产中普遍存在盲目使用农药来预防和治疗病害的现象，严重影响了柑橘的品质及食用安全性，与发展绿色、高效、精细农业的目标不相符。快速、准确地鉴别柑橘病害，对于柑橘效益和品质的提高具有重要意义。

传统的植物病害检测方法主要是根据病株和病原外部表现靠肉眼观察症状而作出判断，这种方法快速简便，但主观性强、容易出现失误；化学检测方法准确、可靠，但难以实现实时检测；生物学检测、显微检测方法需要进行病原体分离、培养、接种和鉴定或制样、染色等较为复杂的过程[3]；分子生物学手段如脱氧核糖核酸（DNA）指纹图谱技术、酶联免疫吸收分析（ELISA），聚合酶链式反应（PCR）用于植物病害鉴别，结果可靠，但需经过复杂的操作过程和较为专业的设备，成本高[4]。生产上需要一种快捷、准确、低成本鉴别作物病害的方法，而振动光谱技术能满足这一需要。

振动光谱技术中的光学成像、光谱学检测方法由于方便、快速、无损等优点，已经广泛用于农业生产的病虫害研究，近红外光谱、荧光光谱、高光谱和多光谱成像系统在病虫害检测实践中得到应用，并表现出具有广阔的发展前景。Pereira等[5]利用激光诱导荧光成像技术检测柑橘黄龙病，Lins等[6]利用荧光光谱检测柑橘溃疡病和杂色萎黄病。荧光光谱成像和图像技术也存在缺陷，容易受到外界环境因素的影响且不能进行统计分析[3]。Sankaran等[7]基于可见-近红外光谱、热成像技术与支持向量机结合实现了对柑橘黄龙病和正常叶的鉴别；Sankaran等[8]基于可见-近红外光谱技术结合二次判别分析和相似分析法可对柑橘黄龙病和正常叶进行分类；Gonzalez等[9]对柑橘黄龙病叶片中多糖的含量进行研究，结果显示黄龙病叶片中多糖含量高于正常叶。

傅里叶变换红外光谱（FTIR）用于测量分子官能团的振动模式，具有指纹特性，已成为探测生物组织中大分子结构及相互作用的手段。FTIR在中药鉴别、农作物病虫害检测、农产品质量检测等方面得到了具体的应用，研究者尝试将其用于在柑橘病害检测，Cardinali等[10]利用FTIR与偏最小二乘回归对巴西柑橘黄龙病和杂色萎黄病进行鉴别，Sankaran等[11]利用FTIR与二次判别分析和K最近邻法鉴别柑橘黄龙病和正常叶片，Hawkins等[12]利用FTIR鉴别柑橘黄龙病、衰退病和裂皮病。

目前病害对柑橘叶片化学成分影响的研究相对较少，难以提供病害前后化学分子结构改变的准确信息。实现准确、快速的早期检测，及时诊治柑橘病害，对柑橘产业的发展具有较大的现实意义。已有研究多为采用有监督模式识别方法对柑橘病害进行判别分析，鲜见利用FTIR同时研究柑橘细菌和真菌性病害并进行聚类分析的研究。本研究基于FTIR并结合无监督模式识别方法对柑橘褐斑病、黄龙病、溃疡病、煤烟病、芽枝孢霉斑病病害叶片和正常叶片进行鉴别，同时对病害叶片化学成分及其相对含量的变化做相关定性分析，研究对象包括柑橘细菌性病害黄龙病和溃疡病，真菌性病害褐斑病、煤烟病和芽枝孢霉斑病。

1 材料与方法

1.1 仪器设备和参数

试验使用德国Bruker公司生产的Tensor27型傅里叶变换红外光谱仪，测定范围为4 000～400 cm-1，分辨率为4 cm-1，扫描次数为16次，装备DTGS探测器。

1.2 样本制备和光谱数据处理

40个柑橘叶片样本均采自云南省大理白族自治州宾川县同一果园，叶片样本包括正常7个、褐斑病5个、黄龙病8个、溃疡病8个、煤烟病6个、芽枝孢霉斑病6个。将样本晾干后，病害叶取病斑部位，正常叶取与病害叶病斑对应部位。把干燥样本与适量溴化钾混合后研磨，压片测试，共测试了40个样本的傅里叶变换红外光谱。使用红外光谱数据处理软件OMNIC 8.0对所采集的红外光谱进行基线校正、9点平滑归一化预处理，并利用统计软件SPSS 16.0进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 柑橘叶片的光谱特征

进行柑橘正常、褐斑病、黄龙病、溃疡病、煤烟病、芽枝孢霉斑病叶片红外光谱分析（图1）可见，5种患病叶片和正常叶片有部分共同特征峰。3 400 cm-1附近有一个极强且宽的吸收峰，主要是羟基伸缩振动吸收；3 000～2 848 cm-1范围内是甲基、亚甲基的伸缩振动区；2 917 cm-1附近的吸收峰归属为CH2反对称伸缩振动；2 850 cm-1附近的吸收峰归属为CH2对称伸缩振动；1 735 cm-1附近吸收峰主要来自脂类C=O伸缩振动[13]；1 700～1 500 cm-1范围是纤维素、半纤维素和木质素吸收的叠加；1 610和1 600 cm-1附近吸收峰主要是木质素C=O伸缩振动吸收[10，13]。

1 200～500 cm-1主要是脂肪酸和多糖的混合振动吸收区；1 424 cm-1附近的吸收峰归属为CH剪式振动吸收；在1 450～1 320 cm-1附近的吸收峰主要为纤维素、木质素中CH3和CH2受氧、氮原子影响时的对称弯曲振动及CH3剪式振动吸收[11]；1 370 cm-1附近的吸收峰归属为纤维素或者半纤维中CH弯曲振动；1 270 cm-1附近的吸收峰为木质素中苯羟基C-O的伸缩振动；1 260 cm-1附近吸收峰归属为半纤维素中C-O伸缩振动；1 200～700 cm-1主要是多糖及其糖类异构体的吸收；1 104 cm-1和1 037 cm-1附近吸收峰归属为碳水化合物（纤维素、半纤维素）中C-O和C-C伸缩振动[12-14]，并且红外光谱在这个范围内有一个强度大、峰形宽的阶梯峰，这个阶梯峰由3个小的吸收峰组成，分别位于1 148、1 105、1 037 cm-1附近，并且这3个吸收峰的强度随波数增加增强，主要来自纤维素中C=O伸缩振动吸收。通过柑橘叶片的傅里叶变换红外光谱图可以看出，柑橘叶片的主要成分是脂类和多糖。

2.2 不同样本特征吸收峰的比较

比较40个样本的FTIR光谱图，其主要特征吸收峰比较相似，但在1 350～750 cm-1范围内不同病害叶的光谱在峰形、峰位、峰强上存在一些差异，具有明显的指纹性和特征性，这可能是由于致病微生物不同引起的，从而导致某些化学成分构型或含量发生了微小的变化。芽枝孢霉斑病木质素吸收峰在1 610 cm-1附近，而其他样本均在1 606 cm-1附近，降低了约4 cm-1；煤烟病在2 917 cm-1和2 850 cm-1附近吸收峰的强度比其他样本强很多；正常叶片在1 516 cm-1附近为宽的肩峰，而其他样本均为明显的尖峰，正常叶片在1 077 cm-1和1 048 cm-1成双峰，而其他样本则为宽的吸收峰；黄龙病多糖最强吸收峰出现在1 037 cm-1附近，而正常叶片出现在1 047 cm-1附近，相差约10 cm-1。黄龙病8个样本的吸收强度比A1047/A2917都大于1.423，正常叶片7个样本对应的比值都小于1.173，表明黄龙病叶片中多糖的含量比正常叶高，这与国内外研究的结果相同[9]，推断吸收强度比A1047/A2917的比值可作为判断是否患有黄龙病的一个依据。

2.3 不同样本二阶导数相关分析

在1 200～700 cm-1范围内样本之间的光谱差异并不十分明显（图1），由于导数光谱具有更高的分辨率、能够显示更多的信息，故试验对40个样本的红外光谱进行二阶导数比较和分析（图2），分析采用Savitsky–Golay方法。从图2可见，所有样本在1 740、1 515、1 231 cm-1附近等都有吸收峰。它们之间的主要区别如下：835 cm-1附近正常叶没有出现吸收峰，而病害叶均有吸收峰；褐斑病在1 018 cm-1附近出现吸收峰，而其他样本在1 032、1 013 cm-1附近出现双的吸收峰；黄龙病在2 355 cm-1附近出现弱的吸收峰，而其他样本均没有出现；1 452、

1 392、1 175 cm-1附近只有正常叶出现吸收峰，而其他病害叶都没有出现；922 cm-1附近煤烟病、芽枝孢霉斑病几乎没有吸收峰，其他样本均出现强的吸收峰；1 368 cm-1和1 273 cm-1附近褐斑病出现强吸收峰，其他样本基本没有出现。选取1 200～700 cm-1范围内二阶导数红外光谱进行相关分析。结果显示，正常叶片之间、同种病害叶片之间的相关系数都在0.918以上，表明同种病害叶片所含的化学成分相同或相对含量相近，不同病害叶、正常叶和病害叶之间的相关系数相差较大，如褐斑病叶和正常叶相关系数为0.673～0.899，黄龙病叶与正常叶相关系数为0.662～0.818；溃疡病叶与正常叶的相关系数为0.465～0.769，煤烟病叶与正常叶相关系数最低，为0.408～0.678。从整体上看，病害叶和正常叶以及不同病害叶之间的相关系数不一样，表明不同病原微生物对柑橘叶片的影响不同。

2.4 二阶导数光谱主成分分析

主成分分析（PCA）是一种数据压缩的常用方法，不但能够降低数据维数，也能通过样本在各因子的空间得分确定所属类别。选取1 200～700 cm-1范围内的原始光谱、一阶导数光谱做主成分分析，正确率分别为60.0%、87.5%。选取该范围二阶导数光谱做主成分分析，前3个主成分得分投影结果见图3。从图3可见，正常叶独自成一类，很容易从病害叶中区分出来；PC2和PC3能够把芽枝孢霉斑病和正常及其他病害叶片区分开；PC1和PC3能够把煤烟病、正常及其他病害叶区分开；PC1和PC2能够把黄龙病、褐斑病、溃疡病叶片区分开，但褐斑病有一个样本错误分类到黄龙病中，溃疡病有一个样本错误分类到煤烟病中，黄龙病有一个样本错误分类到褐斑病中，通过PC1、PC2、PC3能把40个样本分为6大类，其正确率为92.5%。真菌性病害和细菌性病害叶片分别投影到不同的区域，而正常叶独自投影到一个区域，由此间接说明病害叶和正常叶所含有的化学成分或其相对含量不同。

2.5 二阶导数光谱系统聚类分析

聚类分析（HCA）中样本之间相似性的量度用距离表示，距离越近表示越相似，越容易聚在一起形成一类。采用欧氏距离平方和计算法，对40个样本在1 200～700 cm-1范围内的原始光谱、一阶和二阶导数光谱分别进行聚类分析。原始光谱和一阶导数光谱聚类正确率分别为52.5%、80.0%。从二阶导数光谱聚类树状图（图4）看出所有样本分为6类，距离在5以内黄龙病与褐斑病聚成一类，距离在10以内芽枝孢霉斑病、煤烟病、溃疡病、黄龙病、褐斑病聚成一类；距离在20以内病害叶与正常叶聚成一类。但褐斑病（b1）错误归类到溃疡病中，褐斑病（b3）错误归类到黄龙病中，黄龙病（c3）和正常叶（a5）不能很好地归类，40个样本聚类正确率达90.0%。同种病害先聚成一类，然后细菌性病害和真菌性病害各聚成一类，最后与所有样本聚成一类。

3 结论

对柑橘病害叶样本进行了傅里叶变换红外光谱分析，正常叶和病害叶的红外光谱有一些微小差别，二阶导数光谱在1 200～700 cm-1范围内有明显的差异，这个范围内的相关系数表明病原微生物对柑橘叶片化学成分有影响。选取这个范围内原始光谱、一阶和二阶导数光谱分别进行主成分分析和聚类分析，能够对病害叶和正常叶进行很好地分类。结果表明，傅立叶变换红外光谱技术进行柑橘病害鉴定具有快速、无损、便捷、准确的优点，有望发展为柑橘病害早期检测的有效方法。

参考文献：

[1]李红叶.柑橘病害发生与防治彩色图说[M].北京：中国农业出版社，2010.

[2] BARRECA D，BELLOCCO E，GATTUSO C，et al. Elucidation of the flavonoid and furocoumarin composition and radical-scavenging activity of green and ripe chinotto（Citrus myrtifolia Raf.） fruit tissues，leaves and seeds[J]. Food Chemistry，2011， 129（4）：1504-1512.

[3] EHSANI R，MISHRA A，SANKARAN S，et al. A review of advanced techniques for detecting plant diseases[J].Computers and Electronics in Agriculture，2010，72（2）：1-13.

[4] LIN H，CHEN C W，DODDAPANENI H，et al.A new diagnostic system for ultra-sensitive and specific detection and quantification of candidatus liberibacter asiaticus， the bacterium associated with citrus Huanglongbing[J]. Journal of Microbiological Methods，2010，81（1）：17-25.

[5] PEREIRA F M V， MILORI D M B P， RODRIGUES E， et al. Laser-induced fluorescence imaging method to monitor citrus greening disease[J]. Computers and Electronics in Agriculture，2011，79（1）：90-93.

[6] LINS E C， BELASQUE J， MARCASSA LG. Detection of citrus canker in citrus plants using laser induced fluorescence spectroscopy[J]. Precision Agriculture，2009，10（1）：319-330.

[7] SANKARAN S， MAJA J M， BUCHANON S. Huanglongbing （Citrus Greening） detection using visible， near infrared and thermal imaging techniques[J].Sensor，2013，13（2）：2117-2130.

[8] SANKARAN S， EHSANI R. Visible-near infrared spectroscopy based citrus greening detection：Evaluation of spectral feature extraction techniques[J].Crop Protection，2011，30（11）：1508-1513.

[9] GONZALEZ P，CORCUERA J R D，ETXEBERRIA E，et al. Characterization of leaf starch from HLB-affected and unaffected-girdled citrus trees[J].Physiological and Molecular Plant Pathology，2012，79（1）：71-78.

[10] CARDINALI M C D B，BOAS P R V，Milori D M B P， et al. Infrared spectroscopy： A potential tool in Huanglongbing and citrus variegated chlorosis diagnosis[J].Talanta，2012，91：1-6.

[11] SANKARAN S， EHSANI R， ETXEBERRIA E. Mid-infrared spectroscopy for detection of Huanglongbing （Citrus Greening） in citrus leaves[J].Talanta，2010，83：574-581.

[12] HAWKINS S A，PARK B，POOLE G H，et al.Comparison of FTIR spectra between Huanglongbing （Citrus Greening） and other citrus[J]. Journal of Agriculture and Food Chemistry， 2010，58（10）：6007-6010.

[13] GORGULU S T， DOGAN M， SEVERAN F. The characterization and differentiation of higher plants by fourier transform infrared spectroscopy[J]. Applied Spectroscopy，2007，61（3）：300-308.

[14] MONTI F， ANNA R D， SANSON A.Multivariate statistical analysis approach to highlight molecular processes in plant cell walls through ATR FT-IR microspectroscopy：The role of the α-expansin PhEXPA1 in Petunia hybrida[J].VibrationalSpectroscopy，2013，65：36-43.