HIV病毒核酸载量检测方法研究进展

李育芬 李婕 李艳君

HIV病毒载量是机体每毫升血浆中含HIV-RNA[7]的拷贝数。是病毒复制和机体免疫清除机制共同作用结果，直接反应机体血液内游离病毒含量。

HIV病毒载量检测主要用于已诊断的HIV感染者或艾滋病人抗病毒治疗疗效观察[5]。此外还应用于HIV疫苗研究、试剂的研发生产等。其次在个体诊断方面还可以弥补HIV抗体检测局限性：窗口期、疾病终末期以及HIV感染孕妇所生18个月内婴儿的个体诊断；自身免疫疾病、血液透析、怀孕、肝病、药物、疫苗等导致的HIV抗体不确定结果样本的个体诊断。本文就HIV病毒载量检测方法做一综述。

1 HIV病毒核酸载量检测的常用方法

1.1 bDNA法定量检测： 分枝DNA信号放大系统（bDNA）技术，样本用特定裂解液裂解样本后，经探针杂交与信号放大可迅速得到基因定量结果。有灵敏度高、检测范围大和准确定量等优点。亦可通过离心将HIV RNA从病毒颗粒中释放，再用捕获探针1将其捕获到微孔中。捕获探针2与病毒RNA的另一部分特异结合，又与预放大探针结合。后者再与放大探针即bDNA探针杂交。两套靶探针分别与病毒RNA的pol基因的不同区域特异结合。形成HIVRNA寡核苷酸复合物。再加入化学发光底物孵育后放大信号。通过发光强度来定量。该技术的独特分支DNA（人工合成）信号放大系统，其分支可结合多个酶标记物，将捕获的靶标信号放大以便于检测。此检测技术不涉及核酸扩增。根据固相杂交的原理，采用了放大标记探针，目标物不被扩增，但检测信号被放大，提高了灵敏度。bDNA检测步骤[1]：（1）将患者血清或血浆连同含有特异的合成寡聚核苷酸靶探针的裂解液加入微孔；（2）孵育。可释放病毒核酸，降解RNA酶或使DNA变性，然后靶探针结合到靶RNA或DNA并固定在固相板上；（3）冷却洗板；（4）加信号放大探针 （bDNA）到各孔内；（5）孵育。此步骤使bDNA杂交到靶探针的相应部位；（6）冷却洗板；（7）加标记探针到各孔内；（8）孵育，此步骤使酶标记的探针杂交到bDNA上；（9）冷却洗板；（10）加化学发光底物到各孔中；（11）孵育，酶和底物相互作用，产生化学发光信号。产生的光强与样品病毒RNA或DNA的载量成正比。各样品中病毒核酸的含量由与样品一同处理的标准所制作的标准曲线计算获得。

1.2 NASBA检测法：依赖核酸序列的扩增（NASBA）法，由一对特异的引物介导、三种酶催化的以单链RNA为模板的恒温扩增技术，有操作简单、特异性强、灵敏度高、不易被污染等优点[3]。其步骤为：

1.2.1 核酸提取：按常规RNA提取方法，亦可根据需要自选。

1.2.2 核酸扩增：将纯化RNA加到標准NASBA反应体系，在65℃下作用5min去除RNA二级结构，再在恒温的42℃下开始扩增反应。

1.2.3 产物的检测：

1.2.3.1 直接检测：是早期方法。反应产物直接在琼脂糖甲醛变性凝胶上电泳，溴化乙锭染色，紫外灯下观察单链RNA片段的长度。

1.2.3.2 寡核苷酸检测法：将NASBA和ELISA结合，把与检测信号有关的物质标记在核酸探针上，检测该信号从而间接检测RNA。通过探针捕获将地高辛标记的探针和NASBA产物的复合物吸附到微量反应板，作用于底物显色，分析吸光度检测RNA产物。

1.3 RT-PCR检测法： 实时荧光定量PCR扩增（real-time PCR），用荧光基团标记探针，5′端标记荧光基团R，3′端标记淬灭基团Q，在没有PCR扩增时，荧光基团和淬灭基团距离很近，使荧光基团被淬灭，不发荧光；而PCR扩增时，引物与荧光标记的特异性探针同时结合在模板上，荧光标记的探针与模板的结合位置位于上下游引物之间，用Taq酶的5′-3′外切酶活性，荧光探针水解，荧光基团被释放出来，由于空间上与淬灭基团分开，则发出荧光[2]。发出的荧光被荧光探头检测到，边扩增，边检测，实现了“实时”检测[4]。最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系。因此，获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。该法步骤为[1]：（1）样品制备，抽提和浓缩目标RNA，并除去可能存在的抑制因子。（2）Real-time PCR，检测PCR的产物使用荧光标记的寡核苷酸探针。（3）RT-PCR反应，病毒RNA利用逆转录酶将RNA逆转录为cDNA，再用DNA聚合酶对特定片段进行扩增。（4）检测扩增产物，当病毒载量高时，低循环数即能检测到荧光信号，当病毒载量低时，高循环数时才能检测到荧光。循环数与样品载量成线性关系。利用标准品制作循环数与载量的标准曲线就能对样品载量进行定量。

1.4 逆转录PCR技术： 逆转录PCR（RT-PCR）是将RNA逆转录和cDNA的PCR相结合的技术。它先用反转录酶把RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。该技术灵敏且用途广泛，作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。整过程可粗略分为三个阶段：1.从细胞或组织中提取总RNA。标准的样品处理中，HIV-1RNA是用裂解液裂解病毒颗粒直接从血浆中分离，再用乙醇沉淀RNA。超敏感的样品制备法是高速离心浓缩血浆中HIV-1病毒颗粒，再用裂解病毒颗粒。然后用乙醇沉淀RNA。 2.逆转录实验； 3.扩增内参和目的基因并比较基因表达差异。逆转录PCR步骤为[2]：试剂准备；样品制备；靶RNA逆转录成cDNA；用HIV-1特异互补引物进行靶cDNA PCR扩增；通过比色与探针结合的扩增产物的测定。将已知拷贝数的HIV-1定量标准品加到每一个样品中和HIV-1靶序列共同进行样品制备、逆转录、PCR扩增、杂交和检测并和HIV-1靶序列一起扩增。根据HIV-1定量标准品数据计算样品的HIV-1RNA含量。定量标准品补偿了抑制因素的影响，扩增过程的质控使样品的HIV–1RNA得以准确定量。Amplicor HIV-1 Monitor 1.0版能定量400～750000 cp/mL的HIV RNA，需0.2mL血浆。超敏试验能检测更低水平HIV RNA，改进包括增加标本用量（0.5mL血浆）、超速离心病毒颗粒、减少重悬液体的体积等，这使检测敏感性提高50cp/mL。但检测上限也下降了（7.5万）。目前应用最广泛的仪器COBAS AMPLICOR在全自动诊断仪上定量测定HIV-1RNA，试剂盒有标准的和超敏感两种样品处理程序，能定量测定含量50-750，000 cp/mL HIV-1RNA。两个版本的程序结合检测范围是50～750000 cp/mL。

2 其它HIV-1病毒载量的方法

除了分枝DNA信号放大系统技术外，核酸扩增技术定量测定血浆HIV-1RNA是使用最广泛方法。近年也对其它方法作了探索。

2.1 HIV-1 RT（逆转录酶）活性的定量检测： 逆转录酶的活性与活病毒颗粒的数量有很好的相关性，测定RT的活性可反映HIV-1活病毒颗粒的数量。以前RT活性测定方法复杂且需同位素，使用受到很大限制。最近发展ELISA法测定RT活性试验，操作简便，价格低廉 [13]。

实验包括病毒颗粒分离和RT活性测定两部分。前者用能结合病毒颗粒的凝胶把病毒从血浆中分离出来，然后把病毒颗粒裂解，收集裂解物用于RT检测。检测程序是：在包被了polyA的孔板中加入RNA模板结合在板底，再加入含有引物和RT底物的混合物，如果有RT活性，将催化合成DNA链，然后加碱性磷酸酶标记的α-BrdU的抗体检测合成产物，再加底物，测定光密度值确定合成的DNA链的量，间接推测RT的活性[14]。经过初步验证，检测灵敏度是0.5gRT∕mL，病毒载量越高，检测RT的阳性率越高。该检测可望用于替代病毒测定。

2.2 血浆HIV-1定量培养：系列稀释的待测血浆与活化的正常人外周血单核细胞（PBMC）共同孵育，用特定的方法，监测病毒的生长状况，从而测定培养病毒的数量[12]。结果以TCID50（半数细胞培养物感染量），及50﹪组织培养感染剂量来表示。这种方法费时、费力且不敏感。应仔细处理标本、尽快送检、选择对HIV易感性强的PBMC。比较可培养的病毒数量与血浆HIV-1 RNA，通常后者是前者的100～10000倍。可能因检测核酸病毒载量实验可检测缺陷的病毒而培养法只检测活病毒。两者在外周血中数量比换算及更可靠、更简便的培养模型的建立是将来该方法发展要解决的难点。

2.3 PBMC的定量培养：测量PBMC中HIV-1感染的细胞数目，包括淋巴细胞和单核细胞。将待检样中的PBMC与活化的正常人PBMC共同培养，监测病毒的生长状况，结果表示为IUPM（即每百万单核细胞的感染单位）。该法需要复杂的细胞培养试剂和设备以及更为复杂的样本收集处理方法且变异度比核酸扩增大[15]。

2.4 血浆P24抗原检测： 病毒载量可通过ELISA检测HIV-1核心蛋白P24抗原测得。除HIV感染急性期和疾病进展到后期，P24抗原一般测不到的。P24抗原的水平与血浆HIV-1RNA并没有很好的相关[7]。故其应用受限。

3 前景展望

随着艾滋病防治工作的深入，HIV核酸检测得到了充分的重视，那么相关技术有望在哪些方面取得突破？

3.1 （bDNA）检测法无扩增物的交叉污染，这较PCR是大进步。bDNA有数十个覆盖整个基因组的探针，方便检测HIV某些变异株，但灵敏度不及PCR，提高bDNA灵敏度是未来发展大难点[12]。

3.2 （NASBA）法是由一对引物介导连续均一体外特异性核苷酸序列等温扩增RNA的新技术。但还存在由于敏感性高造成的假阳性和特异性高造成的假阴性的问题[13]。如何在检测方法上改进使NASBA标准化，是今后的发展方向。

3.3 转录介导的扩增（TMA）是利用RNA聚合酶和逆转录酶等温条件下扩增RNA或DNA的系统。最近研究表明，该方法用于HIV定量检测，灵敏度高于RT-PCR和bDNA方法。

3.4 连接酶酶促链式反应（LCR）是基于靶分子依赖的寡核苷酸探针相互连接的一种探针扩增技术，是继PCR后新发展的一种体外扩增技术[10]。LCR扩增效率与PCR相当。由于有很高的信噪比，其敏感性也很高。产物检测方便、敏感。因此是检测已知序列中点突變的最佳方法。有望用于HIV遗传学研究[11]。

3.5 多聚酶链反应检测法：检测HIV-RNA，先利用逆转录将RNA转录为cDNA，继而以cDNA为模板进行PCR扩增。

PCR技术特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物[6]。每完成1个循环需2～4 min，2～3 h就能将待扩增目的基因扩增放大几百万倍。此方法非常敏感，极微量的污染即可导致假阳性，尤其用于检测逆转录病毒时，非特异性扩增较多，用杂交方法来检测扩增产物是鉴定特异性扩增最好的方法。今后建立一种非同位素的敏感而又简单快速的PCR产物杂交检测方法将进一步推动PCR的应用。

3.6 实时荧光定量PCR技术：反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号实时监测整个PCR进程，通过标准曲线对未知模板进行定量。实现了PCR从半定量到定量的飞跃，它具有特异性强、自动化程度高、有效解决了PCR污染问题等特点。但是无论是相对定量还是标准曲线定量方法仍存在PCR普遍存在的问题有待解决，在标准曲线定量中，标准品的制备目前无统一标准，各实验室所用的生成标准曲线的样品各不相同，致使实验结果缺乏可比性[8]。另外，由于运用了封闭检测，减少了扩增后电泳的检测，因此不能检测扩增产物的大小；因为荧光素的种类以及检测光源的局限性，限制了该技术复合式检测的应用能力，使用成本较高限制推广。

目前有基因扩增（PCR）或信息扩散（bDNA）两大类方法来检测机体血浆或血清中HIV含量。前一种方法的敏感性优于后一种，但后一种检测操作简便，省去基因扩增步骤，假阳性概率大大减少。同一病人或感染者不同时间尽量采用同一方法以便于比较[9]。

总之， HIV病毒载量的方法各有优势，在允许的动态范围内结果有高度相关性，也具有较高的敏感性和重复性。但同一份样本的不同检测方法测得的绝对值却不能直接比较，提示不同的实验室和方法之间仍有很大的差别，因此检测病毒载量必须始终在相同实验室使用相同的方法。

参考文献

[1] 中国疾病预防控制中心.《HIV-1病毒载量测定及质量保证指南》（2007年版）[S].北京，2008年.

[2] 中国疾病预防控制中心.《全国艾滋病检测技术规范》（2009年修订版）[S].北京，2009年.

[3] 杨睿、王孝文、沈克友、付利芝.NASBA技术在动物疫病检测中的应用[J]. 上海畜牧兽医通讯，2012 ，6 ：10-12.