KCa3.1通道抑制剂TRAM-34对TGF-β1诱导系膜细胞增生的影响

付荣国，陈 钊，张 涛，马立群，杜 燕，吴喜利，田李芳，侯静静，刘晓丹，安 鹏，姚纲练

(1.西安交通大学医学院第二附属医院肾病内科，陕西西安 710004；2.西安交通大学医学院，陕西西安 710061；3.西安交通大学医学院第二附属医院中医科，陕西西安 710004；4.西安交通大学医学院第二附属医院干部病房，陕西西安 710004)

慢性肾脏疾病每年以10%的速度在进展。美国肾脏病患者总数已经超过2 000万，医院每年收治肾脏病患者高达100多万。我国目前尚无具体的慢性肾脏病流行病学调查数据，但初步结果显示，40岁以上人群慢性肾脏病的患病率为10%左右。这给社会和家庭造成巨大的的经济负担，迫切需要寻找能够防治慢性肾脏疾病进展的方法或技术。中电导钙激活钾离子通道KCa3.1(intermediate conductance Ca2+-activated K+-channel，IK/KCa3.1/KCNN4)是1997年ISHII等[1]从人胰腺组织中克隆出的一种钾离子通道，属于中电导钙激活钾离子通道和KCNN4基因家族。目前研究发现，其在红细胞[2-3]、T淋巴细胞[4]、肺脏上皮细胞[5]和树突状细胞[6]、血管内皮细胞[7]、肾小管上皮细胞、系膜细胞和成纤维细胞等均有表达[8-10]。抑制KCa3.1通道，可以减少角膜纤维化[10]、抑制肿瘤细胞[11]和血管平滑肌细胞增殖[12]。KCa3.1参与肾囊肿的形成[13]，在单侧输尿管结扎(UUO)大鼠中可以加重肾间质纤维化的发展，敲除或抑制KCa3.1通道可以减少肾脏成纤维细胞增殖，从而减少肾间质纤维化的发生[14]。本实验首次研究KCa3.1通道特异性阻滞剂TRAM-34对TGF-β1诱导的大鼠系膜细胞增生的抑制作用，间接证明KCa3.1可能参与了TGF-β1诱导的肾小球硬化的发生发展过程。

1材料与方法

1.1材料与试剂系膜细胞株(HBZY-1，中国科学院上海生科院细胞资源中心)；DMEM(Gibco)；MTT(Amresco)；DMSO(美国Sigma)；Recombinant Human TGF-β1(Lot#0506S354，上海希美生物科技有限公司)；TRAM-34(Biomol，product No.BML-KC161-0005)；6孔板和96孔板(Nunc)；酶标仪(BIO-RAD 680，美国伯乐)；碘化丙啶(PI，蓝博斯特生物技术有限公司)；RNase(北京柏莱斯特科技发展有限公司)；BD FACSCantoⅡ(美国)；RT-PCR扩增反应试剂盒(天根生化科技有限公司)。

1.2细胞培养及分组HBZY-1细胞在含有200 mL/L胎牛血清的DMEM中培养，取对数生长期的细胞，按1×106个/mL接种于培养皿内，置于37 ℃、50 mL/L CO2孵育箱中继续培养24 h后分组。TGF-β1的浓度根据预实验和文献资料确定为2 ng/mL。配制2 ng/mL TGF-β1储备液，加入抑制剂TRAM-34，使在含有2 ng/mL刺激因子TGF-β1的条件下，TRAM-34的终浓度分别为0、8、16、24 nmol/L。细胞给药分组，即Control组(空白对照组)、TGF-β1+TRAM-34组(共4组，各组TRAM-34浓度分别为0、8、16、24 nmol/L)。各组细胞给药培养24 h后分别进行流式细胞仪检测和MTT实验。

1.3流式细胞仪检测细胞周期的变化细胞按1.2分组给药培养24 h后，2.5 g/L胰酶消化细胞，收集细胞悬液，1 000 r/min离心7 min，用PBS清洗1遍，弃上清。加入700 mL/L乙醇1 mL固定细胞，轻轻混匀，4 ℃放置1～2 h。细胞悬液1 500 r/min离心5 min，弃上清，PBS清洗，1 500 r/min离心5 min，弃上清，加入RNase 100 μL，37 ℃孵育30 min。1 500 r/min离心5 min，弃上清后避光加入PI 400 μL。以标准程序用流式细胞仪检测，一般计数2～3万个细胞，结果用细胞周期拟合软件Modfit分析。

1.4MTT法检测TRAM-34对细胞增殖的抑制作用细胞按1.2分组给药，每孔加入200 μL，培养24 h后，吸弃旧培养液，每孔加入180 μL无血清培养液和MTT溶液20 μL(MTT终质量浓度为0.5 mg/mL)，37 ℃继续孵育24 h，终止培养。吸弃孔内上清液每孔加入150 μL DMSO，振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪上选择490 nm波长测定各孔的吸光度A值，计算平均抑制率，公式为：平均抑制率=(对照组A值-实验组A值)/对照组A值。

1.5RT-PCR技术检测TRAM-34对系膜细胞α-SMA和FSP-1表达的影响将HBZY-1细胞传代并计数接种到细胞培养皿中，贴壁后，根据1.3和1.4实验结果确定TRAM-34最佳抑制浓度，分别作用0、15、30、60 min，采用RT-PCR分别检测系膜细胞α-SMA和FSP-1转录水平表达变化。用Trizol试剂提取各处理条件下的细胞总RNA，使用之前用紫外/可见分光光度计测定RNA的纯度和含量。cDNA合成过程按照TaKaRa公司反转录试剂盒(PrimeScriptⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit)说明书步骤进行。RT-PCR扩增反应使用天根生化科技有限公司的RealMasterMix (SYBR Green)试剂盒进行定量，TaKaRa公司的RT-PCR仪进行实时检测，所有步骤均在冰上进行。PCR的反应条件为：初始变性(95 ℃，3 min)；40个循环的变性(95 ℃，5 s)；退火(58.5 ℃，10 s)；延伸(72 ℃，20 s)；最后延伸(72 ℃，10 min)。α-SMA和FSP-1的序列见表1。

表1 α-SMA和FSP-1的mRNA序列及产物长度

2结果

2.1TRAM-34对细胞周期的影响TGF-β1组(TRAM-34 0 nmol/L)经2 ng/mL TGF-β1刺激系膜细胞24 h，与空白对照组比较，细胞周期G0～G1期细胞百分比明显增高[(48.45±1.89)%、(70.29±1.84)%，P<0.01]，而S期细胞百分比相应下降[(38.54±1.13)% 、(19.56±1.67)%，P<0.01]；TGF-β1+TRAM-34(8、16、24 nmol/L)组系膜细胞G0～G1期百分比明显减少，S期百分比明显增多。与TGF-β1组比较，24 nmol/L TRAM-34组变化最明显[G0～G1期：(70.29±1.84)%、(61.90±1.88)%；S期：(19.56±1.67)% 、(25.52±1.62)%]，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2TRAM-34对细胞增殖的影响各浓度TRAM-34对TGF-β1诱导系膜细胞增生均有抑制作用，其中24 nmol/L组抑制作用最显著，与8 nmol/L和16 nmol/L组比较，差异有统计学意义(P<0.01，图1)。

图1 不同浓度TRAM-34对系膜细胞增殖的影响

2.3TRAM-34对α-SMA和FSP-1表达的影响TRAM-34刺激系膜细胞30 min和60 min，与对照组(0 min)和15 min组相比，α-SMA的mRNA的表达水平明显下降；FSP-1的mRNA表达水平在TRAM-34刺激系膜细胞60 min显著下降(图2)。

图2 TRAM-34对系膜细胞α-SMA(A)和FSP-1(B)表达的影响

3讨论

最近研究发现，中电导钙激活钾离子通道KCa3.1参与肿瘤细胞收缩迁移和血管平滑肌细胞、肾脏成纤维细胞、肺脏上皮细胞的增生过程，抑制KCa3.1可以抑制肿瘤转移、血管硬化和心肌、肺脏、肾脏的纤维化[5,10-12,14-15]。系膜细胞上也有中电导钙激活钾离子通道[9]。本研究首次发现，KCa3.1通道特异性抑制剂TRAM-34可以明显改善系膜细胞周期，使阻滞于G0～G1期的细胞减少，S期细胞的比例增加，间接提示KCa3.1通道参与了TGF-β1诱导的系膜细胞增生。

TRAM-34是中电导钙激活钾离子通道KCa3.1的特异性抑制剂，是一种高度亲脂性、膜通透的三芳香基甲烷TRAM的类似物。TRAM在KCa3.1通道上的结合位点分别为pore region第250位的苏氨酸(简称Thr250)和S6跨膜域第275位的缬氨酸(简称Val275)。文献报道，TRAM-34在作用后90 min以内就可被胞质膜完全内吞，然后与位于细胞内膜的KCa3.1通道上的Thr250和Val275结合，Thr250和Val275在疏水孔道内沿K+选择“滤过器”“GYG”线性排列，Thr250和Val275侧链上的甲基能与TRAM苯环周围的π-电子云通过疏水键紧密结合，从而锁住TRAM[16]。于是，TRAM芳香环的一半遮盖住了“GYG”，由此阻挡了K+内流的途径[17]。而K+内流的减弱钳制膜电位的去极化，使Ca2+的内流随之减弱，并导致相应的细胞活动受到抑制。本实验采用不同浓度TRAM-34作用于TGF-β1诱导增生的系膜细胞，发现TRAM-34的3个浓度组中阻滞于G0～G1期的系膜细胞周期有明显改善，表现为G0～G1期细胞百分比下降，S期细胞百分比增加，与对照组和TGF-β1组相比，差异有统计学意义，提示TRAM-34对TGF-β1诱导的系膜细胞增生具有抑制作用。细胞增生时细胞体积增大，表型转分化，许多细胞出现早衰并由此进入早期凋亡。TRAM-34改善细胞周期，使阻滞于G0～G1期的增生和转分化的系膜细胞进入S期，有助于改善细胞的增生与表型转分化，减少早衰。在MTT实验中也可以得到类似的结果，不同浓度的TRAM-34对细胞增生具有抑制作用，其中24 nmol/L的TRAM-34抑制作用最大。

系膜细胞是肾脏中数量最多的固有细胞之一，具有吞噬、分泌、收缩和迁移等重要特性。在IgA肾病、狼疮性肾炎、局灶阶段性肾小球硬化、膜增生性肾小球肾炎等肾脏疾病的进展中，产生一系列以系膜病变为主要病理变化的肾小球疾病。任何一种肾小球疾病在不同时期内都可见肾小球系膜病变[18]。α-SMA和FSP-1是细胞表型转分化的标志性抗原[19]。FSP-1是一种钙结合蛋白，又称S100A4，它是S100基因家族成员，也是细胞骨架蛋白之一，与微管动力学、细胞支架、信号传递、细胞周期调节、细胞生长和分化紧密相关。在正常系膜细胞、小管细胞和内皮细胞均不能检测到FSP-1，而在成纤维细胞和纤维化的肾脏能检测到其强烈表达[20]。本实验采用24 nmol/L的TRAM-34可以抑制KCa3.1通道的表达，降低α-SMA和FSP-1表达，并呈时间依赖性。提示TRAM-34可以通过抑制KCa3.1通道，改善细胞表型转分化、减少肾脏系膜细胞早衰的作用。进一步观察TRAM-34对细胞胶原产生及相关信号通路的影响，将对肾小球硬化的防治提供有益帮助。

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