HPLC法对唐古特瑞香中瑞香素和芫花素含量的测定

文慧，卢永昌

摘要：建立同时测定唐古特瑞香（Daphne tangutica）中瑞香素和芫花素的含量的HPLC方法。采用Agilent ZORBAX（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱；检测波长为360 nm；柱温为30 ℃。结果表明，瑞香素在0.115～0.920 μg内线性关系良好（R2=0.999 9），其平均回收率为99.19%，RSD=1.2%（n=9）。芫花素在0.011～0.088 μg内线性关系良好（R2=0.999 9），其平均回收率为100.25%，RSD=1.5%（n=9）。该方法样品处理简单、准确度高、分离效果好，适用于该药的成分测定。

关键词： 高效液相色谱；瑞香素；芫花素；唐古特瑞香（Daphne tangutica）

中图分类号：O657.32 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）07-1654-03

Determination of Daphnetin and Genkwanin in Daphne tangutica by HPLC Method

WEN Hui， LU Yong-chang

（College of Life Science and Chemistry， Qinghai University for Nationalities， Xining 810007， Qinghai， China）

Abstract： The high performance liquid chromatography（HPLC） was used to simultaneously determine daphnetin and genkwanin in Daphne tangutica. The samples were separated on Agilent ZORBAX（4.6 mm×250 mm，5 μm） column. Detection wavelength was 360 nm and column temperature was 30 ℃. The results showed that the linear range of daphnetin was good in 0.115～0.920 μg（R2=0.999 9） with the average recovery of 99.19% and RSD of 1.2%（n=9）. The linear range of genkwanin was good in 0.011～0.088 μg（R2=0.999 9） with the average recovery of 100.25% and RSD of 1.5%（n=9）. This method was simple， accurate，and suitable for determining components and quantities of daphnetin and genkwanin in Daphne tangutica.

Key words： HPLC； daphnetin； genkwanin； Daphne tangutica

唐古特瑞香（Daphne tangutica）为瑞香科植物的干燥根及茎[1]，主要分布在青海果洛、玉树、黄南、海北等藏族自治州，生长在海拔2 700～3 100 m的林缘及灌丛中[2]，系传统藏药省相那玛。常用于治疗风湿痹痛、跌打损伤、风湿及类风湿性关节炎等疾病[3]。其主要化学成分为棕榈酸、月桂酸、 β-谷甾醇、7-甲氧基-8-羟基香豆素、瑞香素、芫花素、羟基芫花素、对羟基苯甲酸等[4，5]。

对于唐古特瑞香中含量分析仅见瑞香素的报道[5]，芫花素尚未见报道，本研究采用HPLC梯度洗脱法同时检测唐古特瑞香中的瑞香素和芫花素的含量。试验结果证明，该方法可操作性强、检测灵敏度高、结果准确可靠、重现性好，能有效地控制药品质量。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Agilent 1200 型高效液相色谱仪（配备自动进样器、在线脱气机、四元梯度泵、柱温箱、DAD检测器、Agilent 1200色谱工作站）；KQ-300B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；瑞香素对照品（成都曼思特生物科技有限公司，批号MUST-12071104，纯度≥98%），芫花素对照品（成都曼思特生物科技有限公司，批号MUST-12073001，纯度≥98%），甲醇为色谱纯试剂，其他试剂均为分析纯，水为去离子水。

1.2 色谱条件[6-8]

Agilent ZORBAX柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相：甲醇（A）-0.04%磷酸水溶液（B）进行梯度洗脱：0～10 min，A∶B（39∶61，V/V）；10～15 min，调节流动相A∶B（40∶60，V/V）；15～18 min，调节流动相A∶B （69∶31，V/V）；18～23 min，调节流动相A∶B （72∶28，V/V）；23～40 min，调节流动相A∶B （90∶10，V/V）；检测波长为360 nm，柱温为30 ℃，流速为1 mL/min。

1.3 对照品溶液的制备

精密称取瑞香素对照品适量，加甲醇制成0.460 mg/mL的溶液，作为对照品储备液；精密称取芫花素对照品适量，加甲醇制成0.440 mg/mL的溶液，作为对照品储备液；再精密量取瑞香素、芫花素对照品储备液，加甲醇稀释至刻度得混合后瑞香素、芫花素的浓度分别为0.022、0.023 mg/mL。

1.4 供试品溶液的制备[9]

1.4.1 提取溶剂的选择[10] 取本品粗粉约0.5 g，2份，加入锥形瓶中，分别准确加入70%乙醇（V/V，下同）25 mL、70%甲醇（V/V）25 mL，分别称定重量，超声处理40 min，静置至室温，再称定重量，补足损失的重量，摇匀，用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，精密吸取上述两种供试品溶液各3 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，以峰面积为指标。结果表明，用两种溶剂提取时，瑞香素的峰面积接近，但是芫花素的峰面积相差较大，所以以芫花素的峰面积为指标比较不同溶剂的提取效果。结果表明，乙醇的提取效果较好。故选用乙醇为提取溶剂。

1.4.2 提取溶剂浓度的选择 取本品粗粉约0.5 g，2份，加入锥形瓶中，分别准确加入95%乙醇25 mL、70%乙醇25 mL、50%乙醇25 mL，分别称定重量，超声处理40 min，静置至室温，再称定重量，补足损失的重量，摇匀，用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，精密吸取上述供试品溶液各3 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，以峰面积为指标。结果表明，瑞香素和芫花素峰面积表明用70%浓度的乙醇溶液提取效果最好。故选用70%乙醇为提取溶剂。

1.4.3 提取方法的选择 取本品粗粉约0.5 g，2份，加入锥形瓶中，分别准确加入70%乙醇25 mL，称定重量，分别超声处理40 min，加热回流，静置至室温，再称定重量，用70%乙醇补足损失的重量，摇匀，用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，精密吸取供试品溶液各3 μL，注入液相色谱仪，以峰面积为指标。结果表明，用加热超声方法提取效果最好。故选用加热超声为提取方法。

1.4.4 提取时间的选择 取本品粗粉约0.5 g，3份，加入锥形瓶中，分别精密加入70%乙醇25 mL，称定重量，加热超声40、30、20 min，静置至室温，再称定重量，用70%乙醇补足损失的重量，摇匀，滤过，用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，精密吸取供试品溶液3 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果表明，以芫花素和瑞香素峰面积为指标，超声40 min时，两者含量最高。故选择40 min为提取时间。

1.4.5 供试品溶液的制备 取本品粗粉约0.5 g，加入锥形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，称定重量，加热超声40 min，等至室温，再称定重量，用70%乙醇补足损失的重量，摇匀，用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，待测。见图1。

2 结果与分析

2.1 线性范围的考察

分别精密吸取瑞香素对照品溶液（0.046 mg/mL）和芫花素对照品溶液（0.044 mg/mL）各2.5、5.0、10.0、15.0、20.0 μL，按上述色谱条件进样测定。分别以瑞香素与芫花素的峰面积为纵坐标，相对应的进样量为横坐标，进行线性拟合。瑞香素的回归方程y=3 262.4x+7.221 7，（R2=0.999 9）；芫花素的回归方程为y=3 904.2x+2.621 7，（R2=0.999 9）。表明瑞香素在0.115～0.920 μg，芫花素在0.011～0.088 μg内线性关系良好。见图1。

2.2 精密度

取瑞香素和芫花素的混合对照品，连续进样6次，每次进样10 μL，瑞香素峰面积的RSD为1.10%，芫花素峰面积的RSD为0.97%，表明仪器精密度良好。

2.3 稳定性

精密吸取供试液溶液10 μL，分别在0、2、4、6、12、16 h重复进样6次，测定瑞香素和芫花素峰面积，结果表明，供试品溶液在16 h内稳定，瑞香素和芫花素峰面积RSD分别为1.25%、1.20%。

2.4 重复性

取同一批唐古特瑞香样品，均匀混合后精密称取6份，每份约0.5 g，按上述方法制备，分别进样10 μL，记录峰面积，并计算含量。瑞香素的平均含量为0.360%，RSD为0.76%，芫花素的平均含量为0.025%，RSD为1.00%，表明方法重现性好。

2.5 加样回收试验

取已知瑞香素和芫花素含量的唐古特瑞香样品9份，每份约0.25 g，精密称定，分别在上述9份药材中加入瑞香素的对照品溶液和芫花素对照品溶液，按以上方法进行处理，制得供试品溶液，分别进样10 μL，记录瑞香素和芫花素的峰面积，计算含量，并计算回收率，结果见表1。瑞香素和芫花素的回收率平均值分别为99.19%、100.25%、RSD分别为1.20%、1.50%，表明加样回收率好。

2.6 样品测定

取各供试品0.5 g，按“1.4.5”项的方法制得样品溶液，以上述色谱条件对5个批次的样品进行瑞香素和芫花素含量测定，结果见表2。瑞香素和芫花素的含量平均值分别为0.340%、0.027%。

3 小结与讨论

唐古特瑞香主要分布在青海果洛、玉树、黄南、海北等藏族自治州。生长在海拔2 700～3 100 m的林缘及灌丛中[2]，系传统藏药省相那玛。具有祛风除湿，止痛散瘀等功效，治风湿痹痛、关节炎、类风湿关节痛[3]。

比较了甲醇和乙醇不同溶剂的提取效率，乙醇的提取效果较好。也比较了不同浓度下的乙醇提取，70%的乙醇提取方法较好。同时运用超声和回流两种方式进行提取，用加热超声提取效果较好，所以选取超声提取法。瑞香素在唐古特瑞香中含量较高，芫花素含量较低。采用HPLC梯度洗脱法同时测定瑞香素和芫花素的含量，方法简便，重现性好，快速分离，有助于药材质量控制更加完善。文献中鲜见唐古特瑞香中芫花素的含量的测定的报道。本研究结果表明，该植物中总瑞香素和芫花素的含量平均值分别为0.340%、0.027%。

参考文献：

[1] 青海省药品检验所，青海省藏医药研究所.中国藏药（第一卷）[M].上海.上海科技出版社，1996：545-546.

[2] 中国科学院西北高原生物研究所.青海经济植物志[M].西宁.青海人民出版社，1987：392.

[3] 张 薇，苏 娟，扈晓佳，等.中药祖师麻的三种基源植物的化学及药理活性[J].中国医药工业杂志，2007，38（3）：233.

[4] 袁小红，徐春霞，周 敏，等.唐古特瑞香化学成分的研究[J].天然产物研究与开发，2007（19）：55-58.

[5] 刘荣华，梅崇烨，邵 峰，等.唐古特瑞香化学成分研究[J].中药材，2009，32（12）：1846-1847.

[6] 刘亚蓉.唐古特瑞香中祖师麻甲素的HPLC法含量测定[J].山西中医，2009，30（1）：85-87.

[7] 王红刚.HPLC法测定沉香叶中芫花素含量[J].中医药导报，2008，14（3）：70.

[8] 张保献，原思通，夏 冲.HPLC法测定芫花中芫花素的含量[J].中国中药杂志，1996，21（4）：237-253.

[9] 杨秀娟，洪燕龙，吴 飞，等.HPLC测定钩藤中钩藤碱和异钩藤碱的方法学探讨[J].中国中药杂志，2013，38（5）：720-724.

[10] 董嘉德.超声技术在中药提取中的应用[J].中国药业.2002， 11（11）：55.

1.4.2 提取溶剂浓度的选择 取本品粗粉约0.5 g，2份，加入锥形瓶中，分别准确加入95%乙醇25 mL、70%乙醇25 mL、50%乙醇25 mL，分别称定重量，超声处理40 min，静置至室温，再称定重量，补足损失的重量，摇匀，用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，精密吸取上述供试品溶液各3 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，以峰面积为指标。结果表明，瑞香素和芫花素峰面积表明用70%浓度的乙醇溶液提取效果最好。故选用70%乙醇为提取溶剂。

1.4.3 提取方法的选择 取本品粗粉约0.5 g，2份，加入锥形瓶中，分别准确加入70%乙醇25 mL，称定重量，分别超声处理40 min，加热回流，静置至室温，再称定重量，用70%乙醇补足损失的重量，摇匀，用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，精密吸取供试品溶液各3 μL，注入液相色谱仪，以峰面积为指标。结果表明，用加热超声方法提取效果最好。故选用加热超声为提取方法。

1.4.4 提取时间的选择 取本品粗粉约0.5 g，3份，加入锥形瓶中，分别精密加入70%乙醇25 mL，称定重量，加热超声40、30、20 min，静置至室温，再称定重量，用70%乙醇补足损失的重量，摇匀，滤过，用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，精密吸取供试品溶液3 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果表明，以芫花素和瑞香素峰面积为指标，超声40 min时，两者含量最高。故选择40 min为提取时间。

1.4.5 供试品溶液的制备 取本品粗粉约0.5 g，加入锥形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，称定重量，加热超声40 min，等至室温，再称定重量，用70%乙醇补足损失的重量，摇匀，用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，待测。见图1。

2 结果与分析

2.1 线性范围的考察

分别精密吸取瑞香素对照品溶液（0.046 mg/mL）和芫花素对照品溶液（0.044 mg/mL）各2.5、5.0、10.0、15.0、20.0 μL，按上述色谱条件进样测定。分别以瑞香素与芫花素的峰面积为纵坐标，相对应的进样量为横坐标，进行线性拟合。瑞香素的回归方程y=3 262.4x+7.221 7，（R2=0.999 9）；芫花素的回归方程为y=3 904.2x+2.621 7，（R2=0.999 9）。表明瑞香素在0.115～0.920 μg，芫花素在0.011～0.088 μg内线性关系良好。见图1。

2.2 精密度

取瑞香素和芫花素的混合对照品，连续进样6次，每次进样10 μL，瑞香素峰面积的RSD为1.10%，芫花素峰面积的RSD为0.97%，表明仪器精密度良好。

2.3 稳定性

精密吸取供试液溶液10 μL，分别在0、2、4、6、12、16 h重复进样6次，测定瑞香素和芫花素峰面积，结果表明，供试品溶液在16 h内稳定，瑞香素和芫花素峰面积RSD分别为1.25%、1.20%。

2.4 重复性

取同一批唐古特瑞香样品，均匀混合后精密称取6份，每份约0.5 g，按上述方法制备，分别进样10 μL，记录峰面积，并计算含量。瑞香素的平均含量为0.360%，RSD为0.76%，芫花素的平均含量为0.025%，RSD为1.00%，表明方法重现性好。

2.5 加样回收试验

取已知瑞香素和芫花素含量的唐古特瑞香样品9份，每份约0.25 g，精密称定，分别在上述9份药材中加入瑞香素的对照品溶液和芫花素对照品溶液，按以上方法进行处理，制得供试品溶液，分别进样10 μL，记录瑞香素和芫花素的峰面积，计算含量，并计算回收率，结果见表1。瑞香素和芫花素的回收率平均值分别为99.19%、100.25%、RSD分别为1.20%、1.50%，表明加样回收率好。

2.6 样品测定

取各供试品0.5 g，按“1.4.5”项的方法制得样品溶液，以上述色谱条件对5个批次的样品进行瑞香素和芫花素含量测定，结果见表2。瑞香素和芫花素的含量平均值分别为0.340%、0.027%。

3 小结与讨论

唐古特瑞香主要分布在青海果洛、玉树、黄南、海北等藏族自治州。生长在海拔2 700～3 100 m的林缘及灌丛中[2]，系传统藏药省相那玛。具有祛风除湿，止痛散瘀等功效，治风湿痹痛、关节炎、类风湿关节痛[3]。

比较了甲醇和乙醇不同溶剂的提取效率，乙醇的提取效果较好。也比较了不同浓度下的乙醇提取，70%的乙醇提取方法较好。同时运用超声和回流两种方式进行提取，用加热超声提取效果较好，所以选取超声提取法。瑞香素在唐古特瑞香中含量较高，芫花素含量较低。采用HPLC梯度洗脱法同时测定瑞香素和芫花素的含量，方法简便，重现性好，快速分离，有助于药材质量控制更加完善。文献中鲜见唐古特瑞香中芫花素的含量的测定的报道。本研究结果表明，该植物中总瑞香素和芫花素的含量平均值分别为0.340%、0.027%。

参考文献：

[1] 青海省药品检验所，青海省藏医药研究所.中国藏药（第一卷）[M].上海.上海科技出版社，1996：545-546.

[2] 中国科学院西北高原生物研究所.青海经济植物志[M].西宁.青海人民出版社，1987：392.

[3] 张 薇，苏 娟，扈晓佳，等.中药祖师麻的三种基源植物的化学及药理活性[J].中国医药工业杂志，2007，38（3）：233.

[4] 袁小红，徐春霞，周 敏，等.唐古特瑞香化学成分的研究[J].天然产物研究与开发，2007（19）：55-58.

[5] 刘荣华，梅崇烨，邵 峰，等.唐古特瑞香化学成分研究[J].中药材，2009，32（12）：1846-1847.

[6] 刘亚蓉.唐古特瑞香中祖师麻甲素的HPLC法含量测定[J].山西中医，2009，30（1）：85-87.

[7] 王红刚.HPLC法测定沉香叶中芫花素含量[J].中医药导报，2008，14（3）：70.

[8] 张保献，原思通，夏 冲.HPLC法测定芫花中芫花素的含量[J].中国中药杂志，1996，21（4）：237-253.

[9] 杨秀娟，洪燕龙，吴 飞，等.HPLC测定钩藤中钩藤碱和异钩藤碱的方法学探讨[J].中国中药杂志，2013，38（5）：720-724.

[10] 董嘉德.超声技术在中药提取中的应用[J].中国药业.2002， 11（11）：55.

1.4.2 提取溶剂浓度的选择 取本品粗粉约0.5 g，2份，加入锥形瓶中，分别准确加入95%乙醇25 mL、70%乙醇25 mL、50%乙醇25 mL，分别称定重量，超声处理40 min，静置至室温，再称定重量，补足损失的重量，摇匀，用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，精密吸取上述供试品溶液各3 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，以峰面积为指标。结果表明，瑞香素和芫花素峰面积表明用70%浓度的乙醇溶液提取效果最好。故选用70%乙醇为提取溶剂。

1.4.3 提取方法的选择 取本品粗粉约0.5 g，2份，加入锥形瓶中，分别准确加入70%乙醇25 mL，称定重量，分别超声处理40 min，加热回流，静置至室温，再称定重量，用70%乙醇补足损失的重量，摇匀，用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，精密吸取供试品溶液各3 μL，注入液相色谱仪，以峰面积为指标。结果表明，用加热超声方法提取效果最好。故选用加热超声为提取方法。

1.4.4 提取时间的选择 取本品粗粉约0.5 g，3份，加入锥形瓶中，分别精密加入70%乙醇25 mL，称定重量，加热超声40、30、20 min，静置至室温，再称定重量，用70%乙醇补足损失的重量，摇匀，滤过，用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，精密吸取供试品溶液3 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果表明，以芫花素和瑞香素峰面积为指标，超声40 min时，两者含量最高。故选择40 min为提取时间。

1.4.5 供试品溶液的制备 取本品粗粉约0.5 g，加入锥形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，称定重量，加热超声40 min，等至室温，再称定重量，用70%乙醇补足损失的重量，摇匀，用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，待测。见图1。

2 结果与分析

2.1 线性范围的考察

分别精密吸取瑞香素对照品溶液（0.046 mg/mL）和芫花素对照品溶液（0.044 mg/mL）各2.5、5.0、10.0、15.0、20.0 μL，按上述色谱条件进样测定。分别以瑞香素与芫花素的峰面积为纵坐标，相对应的进样量为横坐标，进行线性拟合。瑞香素的回归方程y=3 262.4x+7.221 7，（R2=0.999 9）；芫花素的回归方程为y=3 904.2x+2.621 7，（R2=0.999 9）。表明瑞香素在0.115～0.920 μg，芫花素在0.011～0.088 μg内线性关系良好。见图1。

2.2 精密度

取瑞香素和芫花素的混合对照品，连续进样6次，每次进样10 μL，瑞香素峰面积的RSD为1.10%，芫花素峰面积的RSD为0.97%，表明仪器精密度良好。

2.3 稳定性

精密吸取供试液溶液10 μL，分别在0、2、4、6、12、16 h重复进样6次，测定瑞香素和芫花素峰面积，结果表明，供试品溶液在16 h内稳定，瑞香素和芫花素峰面积RSD分别为1.25%、1.20%。

2.4 重复性

取同一批唐古特瑞香样品，均匀混合后精密称取6份，每份约0.5 g，按上述方法制备，分别进样10 μL，记录峰面积，并计算含量。瑞香素的平均含量为0.360%，RSD为0.76%，芫花素的平均含量为0.025%，RSD为1.00%，表明方法重现性好。

2.5 加样回收试验

取已知瑞香素和芫花素含量的唐古特瑞香样品9份，每份约0.25 g，精密称定，分别在上述9份药材中加入瑞香素的对照品溶液和芫花素对照品溶液，按以上方法进行处理，制得供试品溶液，分别进样10 μL，记录瑞香素和芫花素的峰面积，计算含量，并计算回收率，结果见表1。瑞香素和芫花素的回收率平均值分别为99.19%、100.25%、RSD分别为1.20%、1.50%，表明加样回收率好。

2.6 样品测定

取各供试品0.5 g，按“1.4.5”项的方法制得样品溶液，以上述色谱条件对5个批次的样品进行瑞香素和芫花素含量测定，结果见表2。瑞香素和芫花素的含量平均值分别为0.340%、0.027%。

3 小结与讨论

唐古特瑞香主要分布在青海果洛、玉树、黄南、海北等藏族自治州。生长在海拔2 700～3 100 m的林缘及灌丛中[2]，系传统藏药省相那玛。具有祛风除湿，止痛散瘀等功效，治风湿痹痛、关节炎、类风湿关节痛[3]。

比较了甲醇和乙醇不同溶剂的提取效率，乙醇的提取效果较好。也比较了不同浓度下的乙醇提取，70%的乙醇提取方法较好。同时运用超声和回流两种方式进行提取，用加热超声提取效果较好，所以选取超声提取法。瑞香素在唐古特瑞香中含量较高，芫花素含量较低。采用HPLC梯度洗脱法同时测定瑞香素和芫花素的含量，方法简便，重现性好，快速分离，有助于药材质量控制更加完善。文献中鲜见唐古特瑞香中芫花素的含量的测定的报道。本研究结果表明，该植物中总瑞香素和芫花素的含量平均值分别为0.340%、0.027%。

参考文献：

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[2] 中国科学院西北高原生物研究所.青海经济植物志[M].西宁.青海人民出版社，1987：392.

[3] 张 薇，苏 娟，扈晓佳，等.中药祖师麻的三种基源植物的化学及药理活性[J].中国医药工业杂志，2007，38（3）：233.

[4] 袁小红，徐春霞，周 敏，等.唐古特瑞香化学成分的研究[J].天然产物研究与开发，2007（19）：55-58.

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[6] 刘亚蓉.唐古特瑞香中祖师麻甲素的HPLC法含量测定[J].山西中医，2009，30（1）：85-87.

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