miR-149通过靶向FOXM1基因抑制前列腺癌细胞的生长和侵袭

赵 涛 刘家骥

miR-149通过靶向FOXM1基因抑制前列腺癌细胞的生长和侵袭

赵 涛 刘家骥

目的：探讨miR-149对前列腺癌细胞生长和侵袭的影响，并研究miR-149的靶基因及其功能。方法：利用实时荧光定量PCR检测前列腺癌和癌旁组织miR-149和FOXM1 mRNA表达水平。在人前列腺癌细胞系PC3和DU145细胞中瞬时转染miR-149模拟物和阴性对照miRNA，运用平板克隆形成和Transwell侵袭实验检测细胞生长和侵袭。在细胞中分别转染miR-149靶基因FOXM1的siRNA和siRNA阴性对照，利用Western blot检测FOXM1蛋白表达情况，并检测细胞的克隆形成和侵袭能力。结果：在前列腺癌中miR-149低表达（P＜0.01），FOXM1 mRNA高表达（P＜0.01）。与对照组细胞相比，转染miR-149模拟物的PC3和DU145细胞克隆数目减少（P＜0.01），发生侵袭的细胞减少（P＜0.01）；FOXM1蛋白水平在转染miR-149模拟物的PC3（P＜0.01）和DU145细胞（P＜0.05）中较对照组细胞降低。转染FOXM1 siRNA的PC3和DU145细胞中FOXM1蛋白水平较对照组降低，且克隆形成和侵袭能力较对照组明显降低（P＜0.01）。结论：miR-149通过靶向FOXM1抑制前列腺癌细胞生长和侵袭，发挥着抑癌基因的作用，可作为前列腺癌分子治疗的有效靶点。

前列腺癌 miR-149 FOXM1 生长 侵袭

前列腺癌是威胁老年男性健康的常见肿瘤之一，目前对其复发与转移缺乏有效的治疗，影响前列腺癌患者的预后。前列腺癌发病机制尚不明确，研究表明miRNA与前列腺癌的发生、发展密切相关，多种miRNA在非恶性组织和前列腺癌组织存在差异性表达，局限性前列腺癌和转移性前列腺癌中也发现了miRNA表达存在差异［1-2］。miRNA有望成为前列腺癌治疗的重要靶点［3］。但具体何种miRNA与前列腺癌发生、发展有关尚不明确。研究发现miR-149在前列腺癌细胞中低表达［4-5］，但关于miR-149在前列腺癌中作用机制的研究鲜见。本研究证实miR-149在前列腺癌中低表达，并研究miR-149对前列腺癌细胞生长和侵袭能力的影响，探讨miR-149的靶基因FOXM1的功能，为前列腺癌的治疗提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

2010年6月至2013年6月收集重庆医科大学附属永川医院10例经病理学确诊为前列腺癌患者的癌组织和癌旁组织，人前列腺癌细胞系PC3和DU145均由上海抚生实业有限公司提供。转染试剂LipofactamineTM2000购自美国Invitrogen公司。miR-149模拟物序列为5'-UCUGGCU CCGUGUCUUCAC UCCC-3'，模拟物对照序列为5'-UUCUCCGAACGUG UCACGU-3'；FOXM1 siRNA序列为5'-GGACCACUU UCCCUACUUU-3'，对照siRNA序列为5'-GGACCUG UAUGCGUACAUU-3'；均购自上海吉玛技术制药有限公司。反转录酶购自日本Takara公司，实时荧光定量PCR的2×SYBR Green Master Mix购自上海工硕生物技术有限公司。Transwell小室购自美国Millipore公司。兔抗人FOXM1、GAPDH多克隆抗体以及羊抗兔二抗购自英国Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及转染 人前列腺癌细胞系PC3和DU145均采用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养液在5%CO2、37℃孵箱中培养。转染前的第1天细胞接种到6孔板的培养板中，待第2天细胞密度达到80%时，严格按照脂质体LipofectamineTM2000的说明书要求对细胞进行转染。

1.2.2 实时荧光定量PCR 按照Trizol说明书步骤提取总RNA，采用分光光度计测定RNA浓度，行琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的质量。采用特异的miR-149引物进行miRNA逆转录反应（RT），同时以U6作为内参；OligodT作为通用引物进行基因FOXM1的逆转录反应，同时以β-actin作为内参。实时荧光定量PCR反应体系：cDNA 1 μL、引物各1 μL，2×SYBR Green Master Mix 10 μL，无菌蒸馏水7 μL。反应程序：95℃预变性3 min，95℃变性15 s、58℃退火30 s、72℃延伸30 s，共进行40个循环。

1.2.3 平板克隆形成实验 按要求将转染后的前列腺癌细胞以2×102个/孔细胞接种到12孔板，使单个细胞分散均匀，置于细胞培养箱内培养。每隔3天换1次细胞培养液，当细胞形成肉眼可见的克隆时，终止培养，PBS清洗细胞，利用5%结晶紫进行染色并拍照计数。各细胞样本接种3个复孔。

1.2.4 Transwell侵袭实验 将转染24 h后的前列腺癌细胞进行消化，重悬于无血清RPMI 1640培养液中，接种到Matrigel（终浓度为1 mg/mL）覆盖的Transwell上层小室内，小室底部为常规培养基。24 h后取出小室，甲醛和乙酸的混合液固定细胞15 min，PBS清洗，再用棉签擦去未穿过小室膜的细胞。结晶紫进行染色，染色后使用PBS冲洗。随机选择3个视野拍照计数，计算每个视野下平均发生侵袭的细胞数目。

1.2.5 Western blot实验 PBS清洗转染48 h后的前列腺癌细胞，使用含50 mM Tris-Cl、150 mM NaCl、 1%TritonX-100和0.1%SDS的RIPA裂解液提取细胞蛋白。应用BCA法测定蛋白质的浓度。取30 μg蛋白进行SDS-PAGE电泳，转膜后5%脱脂牛奶封闭。一抗4℃孵育过夜，TBST缓冲液洗膜。二抗室温孵育1 h后显影。

1.3 统计学分析

采用SPSS 18.0统计软件对数据进行统计学分析。计量资料以±s表示。组间数据的差异采用双侧样本的Student's t检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 实时荧光定量PCR检测前列腺癌组织和癌旁组织中miR-149及FOXM1 mRNA表达

实时荧光定量PCR检测10例前列腺癌组织和癌旁组织miR-149和FOXM1 mRNA的表达情况，结果显示miR-149在前列腺癌组织中的表达为4.214± 1.023，明显低于癌旁组织的9.045±2.358（P＜0.01）；FOXM1 mRNA在前列腺癌组织的表达为0.733± 0.057，高于癌旁组织的0.282±0.040（P＜0.01）。

2.2 miR-149对前列腺癌细胞增殖和侵袭的影响

平板克隆形成实验检测人前列腺癌细胞系PC3和DU145的增殖能力，与对照组比较转染miR-149模拟物的PC3和DU145细胞的克隆数目均明显减少，两组差异具有统计学意义（P＜0.01，图1）。利用Transwell小室实验检测细胞的侵袭能力，结果显示，与对照组比较，转染miR-149模拟物的PC3和DU145的细胞穿透膜的数目均减少，且两组差异具有统计学意义（P＜0.01，图2）。

2.3 miR-149过表达和siRNA对FOXM1蛋白水平的影响

Western blot检测结果显示，转染miR-149模拟物的PC3（P＜0.05）和DU145（P＜0.01）细胞中FOXM1蛋白水平分别较对照组明显降低（图3）。转染FOXM1的siRNA的前列腺癌细胞中FOXM1蛋白水平较对照组明显降低（P＜0.01），且siRNA在2种前列腺癌细胞中具有一致的效果（图4）。

2.4 FOXM1对前列腺癌细胞生长和侵袭的影响

平板克隆形成实验结果显示，转染FOXM1 siRNA的PC3细胞克隆形成数为（19.8±4.3）个，较siRNA对照组（68.3±8.4）个明显减少（P＜0.01），转染FOXM1 siRNA的DU145细胞克隆形成数为（32.1±5.7）个，较siRNA对照组（86.5±9.1）个明显减少（P＜0.01）。

Transwell侵袭实验结果显示，PC3细胞转染FOXM1 siRNA后穿透细胞膜数目为（57.3±8.8）个，较siRNA对照组（117.1±18.9）个明显减少（P＜0.01），DU145细胞转染FOXM1 siRNA后穿透细胞膜数目为（35.5±7.6）个，较siRNA对照组（91.9±11.4）个明显减少（P＜0.01）。

图1 平板克隆形成实验检测miR-149过表达对前列腺癌细胞增殖的影响Figure 1 Effects of miR-149 over expression on prostate carcinoma cell proliferation were tested in terms of colony formation assay

图2 Transwell侵袭实验检测miR-149过表达对前列腺癌细胞侵袭的影响Figure 2 Effects of miR-149 over expression on prostate carcinoma cell invasion were tested via Transwell invasion assay

图3 Western blot检测过表达miR-149对FOXM1蛋白水平的影响Figure 3 Effects of miR-149 over expression on expression of FOXM1 detected by Western blot

图4 Western blot检测FOXM1 siRNA对FOXM1蛋白水平的影响Figure 4 Effects of FOXM1 siRNA on the expression of FOXM1 protein detected via Western blot

3 讨论

miRNA通过调控部分编码蛋白基因的表达，参与细胞活动的调节，调控不同的生物学进程［6］。miRNA对靶基因的调控并非一对一的关系，单个miRNA可以调控多个靶基因，且在不同的细胞条件下可能引起功能发生变化，导致研究结果不一致。某些特异性miRNA参与肿瘤的发生和进展，可作为组织或肿瘤特异性标志，有利于肿瘤的临床诊断、治疗及预后分析。近年来认为，miRNA表达变化及其调控基因在前列腺癌的发生、发展过程中起重要作用，且众多研究发现多种miRNA在前列腺癌组织及各种前列腺癌细胞株中异常表达［7-10］。但目前关于前列腺癌miRNA差异表达的相关研究结果仍存在争议，且机制也不明确。

有研究发现，miR-149在前列腺癌细胞中低表达［4-5］，本研究也通过实时荧光定量PCR对10例前列腺癌组织和癌旁组织进行检测，证实了miR-149在前列腺癌组织中低表达。本研究在前列腺癌细胞PC3和DU145中转染miR-149模拟物，克隆形成实验结果表明，过表达miR-149抑制前列腺癌细胞的增殖，同时Transwell实验表明过表达miR-149的前列腺癌细胞侵袭能力明显减弱。结果显示前列腺癌细胞PC3和DU145结果趋于一致。提示miR-149可能作为一种抑癌基因，参与了肿瘤的生长和转移。

FOXM1是FOX基因家族的成员之一，在细胞增殖、凋亡、DNA损伤和肿瘤形成等许多生理过程中均发挥作用［11-13］。有研究利用芯片技术检测前列腺癌组织的基因表达谱发现，FOXM1在转移性前列腺癌的表达显著增高［14］，本研究证实FOXM1 mRNA在前列腺癌组织中表达高于癌旁正常组织。前列腺癌FOXM1蛋白的表达水平显著高于前列腺良性增生组织，提示FOXM1与前列腺癌发生和恶性进展显著相关［15］。亦有研究发现，在非小细胞肺癌细胞中miR-149通过抑制FOXM1的表达发挥肿瘤抑制基因的作用［16］。本研究Western blot检测结果显示，过表达miR-149的前列腺癌细胞FOXM1的蛋白水平明显降低；且通过RNA干扰技术敲降细胞中FOXM1的表达，平板克隆形成实验和Transwell小室实验结果显示，敲降FOXM1的表达后细胞的克隆形成能力和侵袭能力降低，表明FOXM1可能在前列腺癌细胞中发挥着抑癌基因的作用。这进一步证实了miR-149通过靶向FOXM1调控前列腺癌细胞生长和侵袭，发挥着抑癌基因的作用。

综上所述，在前列腺癌细胞中miR-149通过靶向FOXM1而抑制前列腺癌细胞的生长和侵袭，发挥着癌基因的作用，可作为前列腺癌分子治疗的有效靶点。为验证miR-149是否在体内也发挥癌基因的作用，将来需在动物模型上进行进一步研究，为探索前列腺癌治疗的分子靶点奠定基础。

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（2014-03-12收稿）

（2014-07-17修回）

miR-149 inhibition of cell growth and invasion by targeting FOXM1 in human prostate carcinoma

Tao ZHAO,Jiaji LIU

Jiaji LIU;E-mail:Jiaji_liu@163.com
The Affiliated Yongchuan Hospital of Chongqing Medical University,Chongqing 402160,China.

Objective:To investigate the effects of the miR-149 on the growth and invasion of prostate carcinoma cells.Methods:Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction was performed to detect the expression of miR-149 on prostate carcinoma tissues and paraneoplastic tissues.The PC3 and DU145 cells were transfected with miR-149 mimics and negative controls.The cell growth and invasion abilities were tested in terms of colony formation and via Transwell invasion assay.The cells were transfected with the siRNA of the target gene FOXM1 and siRNA control.Western blot was used to detect the expression of FOXM1.The cell colony formation and invasion ability were also detected.Results:Compared with the paraneoplastic tissues,miR-149 was down-regulated in the prostate carcinoma tissues(P＜0.01),and the FOXM1 mRNA was highly expressed(P＜0.01).PC3 and DU145 cells with miR-149 mimics had only a few colonies and invading cells(P＜0.01).Moreover,PC3(P＜0.01)and DU145(P＜0.05)with miR-149 mimics had a low protein level of FOXM1.The FOXM1 expression was knocked down by the siRNA of FOXM1 in the PC3 and the DU145 cells(P＜0.01).The knocking down of FOXM1 resulted in an inhibition of the cell colony formation and invasion abilities(P＜0.01).Conclusion:The miR-149 inhibits prostate carcinoma cell growth and invasion by suppressing the FOXM1.Our data suggest that miR-149 may function as an effective tool for the molecular treatment of prostate cancer.

prostate carcinoma,miR-149,FOXM1,cell growth,invasion

10.3969/j.issn.1000-8179.20140395

重庆医科大学附属永川医院泌尿外科（重庆市402160）

刘家骥 Jiaji_liu@163.com

赵涛 硕士，主治医师。专业方向为泌尿及男性生殖系统肿瘤的诊治。

E-mail：zhaotao_1999@163.com