CHI3L1基因多态性和血清YKL-40水平与支气管哮喘发病的关联性

陈 敏,赖天文,招轩娜,吕莹莹,高拯妮,黄 丹,刘升明

(1.暨南大学附属第一医院呼吸内科,广东广州 510630;2.广东医学院附属医院呼吸内科,广东湛江 524001)

CHI3L1基因多态性和血清YKL-40水平与支气管哮喘发病的关联性

陈 敏1,2,赖天文2,招轩娜2,吕莹莹2,高拯妮2,黄 丹2,刘升明1

(1.暨南大学附属第一医院呼吸内科,广东广州 510630;2.广东医学院附属医院呼吸内科,广东湛江 524001)

目的:观察几丁质酶3类1(CHI3L1)基因多态性与广东地区汉族人群哮喘发病的关联性,探讨采用其编码的几丁质酶样蛋白40(YKL-40)评估病情严重程度及监测病情的临床意义。方法:入选的251例研究对象分为哮喘组(150例)和正常对照组(101例)。采用Massarray法检测CHI3L1基因单核苷酸多态性(SNP),同时检测哮喘组和对照组研究对象血清YKL-40水平、外周血嗜酸性粒细胞百分比(Eos%)、总Ig E和肺功能,同时将哮喘组分为急性加重期和稳定期2个亚组,比较患者血清YKL-40水平的差异。结果:CHI3L1基因位点rs3806448 A/G等位基因在哮喘组和对照组中分布比较差异有统计学意义(P＜0.01),哮喘组患者rs3806448等位基因A频数明显高于正常对照组(OR＝1.93,95%CI＝1.30～2.62,χ2＝11.6,P＜0.01);rs3806448基因型为AA患者血清YKL-40水平、总IgE和Eos%高于基因型为GG或AG患者(P＜0.05);而rs3806448基因型为AA患者一秒用力呼气容积(FEV1)占预计值百分比(FEV1%)低于基因型为GG或AG患者(P＜0.05);哮喘组患者血清YKL-40水平明显高于正常对照组(P＜0.01),哮喘急性加重组患者血清YKL-40水平高于病情稳定组和正常对照组(P＜0.01);哮喘组患者血清YKL-40水平与外周血EOS%及总Ig E水平呈正相关关系(rEos＝0.348,rIgE＝0.437,P＜0.01),与肺功能呈负相关关系(r＝－0.745,P＜0.01)。结论:CHI3L1-rs3806448多态性与广东地区汉族人群的哮喘发病有关联,提示血清YKL-40可能是评价哮喘患者病情严重程度及监测病情变化的一个新生物标志物。

支气管哮喘;单核甘酸多态性;几丁质酶3样蛋白1

目前全球约有3亿支气管哮喘(bronchial asthma,简称哮喘)患者,其中我国约有3千万哮喘患者。哮喘的病因和发病机制非常复杂,至今尚未完全阐明。哮喘发病与多基因有关,同时受遗传因素和环境因素的双重影响[1]。近年的研究[2-3]表明:几丁质酶(chitinase)在哮喘的发病中具有重要作用。几丁质酶具有催化几丁质中β1-4糖苷键水解的功能,使几丁质结构重塑,同时也为有机体提供重要的能量来源。存在于人体内的几丁质酶家族成员有酸性哺乳动物几丁质酶(acid mammalian chitinase,AMCase)和壳三糖苷酶(chitotriosidase,CHIT1)及与之结构相似的几丁质酶样蛋白,如YKL-39和YKL-40等。YKL-40与几丁质酶共同具有a(β/α)8TIM的保守结构,因其催化中心的质子供体谷氨酸为异亮氨酸所替代,不具备几丁质酶的活性,但其具备与几丁质结合的能力。YKL-40在哮喘患者血液和肺部的含量增加,与哮喘严重程度和表皮下基底膜增厚(气道重塑)有关[4]。几丁质酶3类1(chitotriosidase 3-like 1,CHI3L1)编码YKL-40蛋白,且CHI3L1启动区的单核苷酸多态性与血清YKL-40水平、基因表达差异和转录水平相关[5-6]。哮喘具有多基因遗传,具有明显的遗传异质性,这意味着某些群体中发现的遗传易感基因在另外的群体中不一定能发现。为了确定CHI3L1基因是否是广东汉族人群发生哮喘的危险因素,本文作者采用病例对照法研究CHI3L1启动子区域的3个单核苷酸多态性(SNPs)(rs10494132、rs3806448及rs2275254)与哮喘发病、血清YKL-40水平、外周血嗜酸性粒细胞百分比(Eos%)、总免疫球蛋白E(IgE)和肺功能的关联性,同时评价哮喘患者血清YKL-40与外周血Eos%、总IgE和肺功能的关联性,为哮喘的诊治提供依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象

入选标准采用2009年全球支气管哮喘防治创议(Global Initiative for Asthma,GINA)提出的哮喘诊断标准[7]。排除标准:并发有严重心肺疾病患者;并发有过敏性鼻炎等过敏性疾病的患者;有吸烟史(＞20支/年)的患者;不能进行肺功能测试的患者。2011年1月—2012年12月选取广东医学院附属医院门诊或住院的哮喘患者150例,同期在体检中心选取101名健康体检者作为正常对照组。哮喘患者又分为急性加重和稳定期2个亚组。本研究通过广东医学院附属医院伦理委员会的审核,所有研究对象均已签署知情同意书。

1.2 哮喘患者分组

1.2.1 哮喘急性加重组 哮喘急性加重定义为喘息、气促、咳嗽和胸闷等症状突然发生,或原有症状急剧加重,常有呼吸困难,以一秒用力呼气容积(forced expiratory volume in one second,FEV1)降低为其特征[7]。在本研究中,因哮喘急性发作到门诊或急诊就诊的患者且FEV1＜90%预计值时纳入为急性加重组,共50例。排除标准:并发肺癌、关节炎、肝硬化、2型糖尿病及口服激素或在4周内曾发生肺炎的患者。在患者就诊后6 h内采集外周血。

1.2.3 哮喘稳定期组 哮喘稳定期定义为症状和肺功能稳定至少维持4周[7]。当稳定期患者在门诊定期随访时纳入哮喘稳定期组,共100例。患者在门诊随访时采集外周血。

1.3 基因多态性检测

所有研究对象的静脉血用EDTA抗凝,以全血基因组DNA提取试剂盒(Qiagen公司,德国)抽取DNA,经测定其浓度达20～60 mg·L－1。将提取出来的基因组DNA进行目的基因的扩增。采用Assay Design 3.1软件(Sequenom公司)进行引物设计并由Ta KaRa宝生物工程(大连)有限公司合成(表1)。在SNP位点处延伸上带有荧光信号标记单个碱基。PCR反应条件:94℃预变性15 min; 94℃变性20 s,56℃退火30 s,72℃延伸60 s,共40个循环;72℃终末延伸3 min。应用Sequenom Massarray(Sequenom公司,美国)检测扩增的PCR产物,根据单碱基延伸的等位基因的相对分子质量差异进行基因分型。

1.4 血清YKL-40水平、外周血总IgE和Eos%测定

采用人YKL-40 ELISA试剂盒(Quidel公司,美国)检测血清YKL-40水平。最低检测浓度小于20 mg·L－1。总Ig E检测采用EDTA抗凝管抽取静脉血2 m L,离心5 min后分离血清,再采用ELISA酶联免疫吸附法,用Beckman-coulter特种蛋白分析仪Immage 800仪器进行检测。采用全自动血液分析仪检测外周血Eos%,操作过程严格按照说明书进行操作。

表1 CHI3L1基因多态性所在DNA片段的PCR引物及单碱基延伸引物Tab.1 Primers of PCR and single base extension primers of CHI3L1 polymorphism

1.5 统计学分析

分别统计哮喘组和正常对照组基因型分布频数,经Hardy-Weinberg平衡检验后,采用SPSS 13.0统计软件进行分析。研究对象年龄、体质量指数(body mass index,BMI)、总IgE、Eos%及FEV1%等以±s表示。年龄、BMI、总IgE、Eos%及FEV1%等组间比较采用t检验,2组间性别比较采用χ2检验。YKL-40水平呈非正态分布,应用非参数检验包括Mann-Whitney U检验和Kruskal-Wallis H检验。YKL-40水平、总IgE、Eos%与肺功能的相关性采用Spearman等级相关分析。基因型和等位基因的分布差异采用χ2检验,采用二分类Logistic回归计算比值比(odds ratio, OR)及95%可信区间(95%CI)。

2 结果

2.1 各组研究对象的基本资料

总IgE和Eos%是与哮喘密切相关的2个特征性指标[8-9]。本研究结果表明:与正常对照组比较,哮喘组患者总IgE和Eos%明显升高,FEV1%明显降低(P＜0.01);与哮喘稳定期患者比较,哮喘急性加重期患者FEV1%明显降低(P＜0.01)。见表2。

表2 各组研究对象的基本情况Tab.2 Basic information of subjects in various groups

2.2 基因多态性测定

与正常对照组比较,哮喘组患者CHI3L1基因启动子rs3806448等位基因A出现频数升高(P＜0.01),哮喘患者rs3806448等位基因A与哮喘发病高度相关(OR＝1.93,95%CI＝1.30～2.62, χ2＝11.6,P＜0.01)。rs3806448特征性质谱图见图1。rs10494132(T/C)和rs2275254(A/G)位点多态性2组间比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见表3。

表3 CHI3L1部分基因多态性检测Tab.3 Detection of parts of CHI3L1 polymorphisms[n(η/%)]

图1 rs3806448的AA、GG和AG特征质谱图Fig.1 Characteristic mass spectra of genotype AA,GG and AG at rs3806448

2.3 rs3806448多态性与哮喘患者YKL-40、总IgE、Eos%及肺功能的关系

rs3806448基因型为AA患者血清YKL-40水平、总Ig E和Eos%高于基因型GG或AG患者(P＜0.05);而rs3806448基因型AA患者FEV1%低于基因型为GG或AG患者(P＜0.05)。见表4。

2.4 各组研究对象血清YKL-40水平

哮喘组患者血清YKL-40水平[(53.3± 7.1)μg·L－1]高于正常对照组[33.8± 4.0)μg·L－1](P＜0.01)。哮喘急性发作组患者血清YKL-40水平[(56.2±6.9)μg·L－1)]高于哮喘稳定期患者[(52.2±6.8)μg·L－1)](P ＜0.05)及正常对照组(P＜0.01)。

2.5 血清YKL-40水平与哮喘患者总Ig E、Eos% 及FEV1%的相关性

哮喘患者血清YKL-40水平与总Ig E(r＝0.437,P＜0.01)及Eos%(r＝0.348,P＜0.01)呈正相关关系,而与FEV1%(r＝－0.745,P＜0.01)呈负相关关系。

表4 rs3806448位点不同基因型哮喘患者YKL-40水平、总IgE、Eos%和FEV1%Tab.4 Levels of YKL-40,total IgE,Eos%and FEV1%of asthma patients with different genotypes of rs3806448

3 讨论

几丁质是广泛存在于自然界的一种含氮多糖类生物性高分子。几丁质酶是动植物在寄生虫、昆虫入侵时产生的酶,可降解几丁质。人类无几丁质,但在基因组中有多种几丁质酶的基因残留,如AMCase和CHIT1等,其表达产物为与之结构相似的几丁质酶样蛋白,如YKL-39和YKL-40。研究[10]发现:几丁质酶及壳多糖酶样蛋白YKL-40是炎症的标记物。编码YKL-40的CHI3L1基因最近被证实与哮喘易感性相关。本研究对CHI3L1基因启动子区域的3个多态性位点进行检测,结果显示:rs3806448 G/A位点变异与哮喘发病有关联,进一步验证了CHI3L1基因与哮喘易感性的关系。CHI3L1基因位于1q32-q32高度保守的区域,总长度约为8 000 bp,共包含10个外显子[11],参与多种疾病的炎症反应和组织结构重塑等病理过程。其机制可能为CHI3L1启动子区域的一个SNP (s4950928,－131Cy G)引起转录因子连接位点的破坏,导致YKL-40基础表达水平下降,而产生哮喘的易感性。因此,变异的－131G等位基因与抗哮喘、气道高反应性和肺功能下降的保护作用相关[]。

Rathcke等[13]报道:rs3806448 G/A启动的多态性与成人和儿童变应性哮喘发病有关(Padult＝0.000 01,Ppediatric＝0.000 2),也与患者外周血总IgE水平有关。Chatterjee等[14]在印度人群中发现:rs3806448基因多态性与过敏性哮喘以及血清总Ig E水平具有显著相关性。在本研究中同样发现:CHI3L1启动子区域的rs3806448多态性与广东地区汉族人群哮喘发病相关。本研究进一步发现,rs3806448基因型GG或AG患者血清YKL-40水平、总IgE和Eos%低于基因型AA患者,而FEV1%高于基因型AA患者,结果表明: CHI3L1基因的SNP是哮喘的一个易感因素,并且携带A等位基因的患者,其患哮喘的风险增加。本文作者推测:该位点可能参与了基因表达和功能的调节,但rs3806448在哮喘的具体作用机制仍未清楚。本研究发现:基因型AA患者血清YKL-40水平明显降低,因此推测这个位点可能通过影响YK-L40的水平来影响哮喘的发病,这是本文作者进一步研究的目标。

本研究结果显示:在广东地区人群中rs10494132和rs2275254基因多态性与哮喘无关联。而Chatterjee等[14]发现:rs10494132多态性与印度人群血清总IgE水平有关,认为rs10494132 的SNP改变了CHIA启动子的转录活性,C突变成T后八聚体转录因子-1的结合位点失去作用。本研究未发现rs10494132多态性与汉族人群哮喘发病相关。Wu等[15]研究发现:CHIA多态性(含 rs10494132)与哮喘无关。Rathcke等[13]在成人及儿童中未发现rs10494132多态性与哮喘发病有关(Padult＝0.46,Ppediatric＝0.76)。本文作者未发现rs2275254多态性与哮喘有关,这与Rathcke等[13]的报道一致。上述研究结论不完全相同,可能原因是哮喘是一种异质性疾病,CHI3L1基因是否在普通哮喘人群或是仅在某一特定的哮喘表型起作用仍不清楚。此外,不同研究对象和研究设计可能导致研究结果的差异。因此,这些相关结论有待于大样本和多种族人群进一步验证。

哮喘气道炎症的评估是哮喘病情评价的重要方面。YKL-40可通过促进哮喘患者Th2活化、分化并减少其凋亡,增加Th2数量,在哮喘慢性气道炎症中起着重要作用[16]。Tang等[5]研究发现:哮喘患者血清YKL-40水平明显升高,且与哮喘患者的严重程度有关。Konradsen等[17]在儿童哮喘患者的研究中发现:病情重、治疗抵抗的哮喘患儿相对于哮喘控制良好的患儿和正常患儿YKL-40水平明显升高,因此YKL-40可预示病情的严重程度,且与CHI3L1基因型有关联。本研究结果显示:哮喘患者血清YKL-40水平与哮喘的急性加重有关,且与患者外周血总IgE及Eos%呈正相关关系,与FEV1%呈负相关关系。这些结果提示:YKL-40可能参与了哮喘的慢性气道炎症过程,Tang等[18]研究发现:YKL-40可通过诱导支气管上皮细胞产生IL-8,参与气道炎症的形成甚至导致支气管平滑肌细胞的增殖和迁移。因此YKL-40可能是一种预测哮喘患者病情严重程度及肺功能下降的生物标记物。但其在哮喘发病中具体的、确切的作用机制仍需进一步深入研究。

综上所述,本研究结果表明:CHI3L1启动子区域的rs3806448多态性与广东地区汉族人群哮喘发病有关,rs3806448基因型AA是哮喘发病的危险因素。哮喘患者血清YKL-40水平升高,与哮喘的严重程度有关,与外周血总IgE和Eos%呈正相关关系,与FEV1%呈负相关关系。因此,血清YKL-40可能是一种预测哮喘急性发作及评价病情严重程度的生物标记物。

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Correlation between CHI3L1 polymorphism and serum YKL-40 and bronchial asthma

CHEN Min1,2,LAI Tian-wen2,ZHAO Xuan-na2,LYU Ying-ying2,GAO Zheng-ni2,HUANG Dan2,LIU Sheng-ming1
(1.Department of Respiratory Medicine,First Affiliated Hospital,Jinan University,Guangzhou 510630,China; 2.Department of Respiratory Medicine,Affiliated Hospital,Guangdong Medical College,Zhanjiang 524001,China)

ObjectiveTo investigate the association between CHI3L1 polymorphism and asthma in the Han population of Guangdong,and to explore the clinical values of chitinase-like protein YKL-40 in evaluating disease severity and monitoring the progression of the disease.MethodsTotal 251 objects were divided into asthma group (n＝150)and control group(n＝101).The single nucleotide polymorphism(SNP)at CHI3L1 gene was detected with Massarray method.The serum YKL-40 levels,total IgE levels,peripheral blood eosinophil percentage (Eos%)of the objects in asthma and control groups were detected.The asthma patients were divied into asthma exacergation group and stable group,and the serum YKL-40 levels were compared.ResultsThe distribution of A/ G at rs3806448 of CHI3L1 had significant difference between asthma and control groups(P＜0.01),and the frequency of A allele at rs3806448 of the patients in asthma group was significantly higher than that in control group (OR＝1.93,95%CI＝1.30－2.62,χ2＝11.6,P＜0.01).The serum YKL-40 levels,total Ig E and Eos%ofthe patients with AA at rs3806448 were higher than those of the patients with GG or AG at rs3806448(P＜0.05); the FEV1%of the patients with AA was lower than those of the patients with GG or AG at rs3806448(P＜0.01).The serum YKL-40 level of the patients in asthma group was significantly higher than that in normal control group (P＜0.01),and the serum YKL-40 level of the patients in asthma exacergation group was higher than those in asthma stable group and normal control group(P＜0.01).The serum YKL-40 level of the patients in asthma group was positively correlated with the peripheral blood Eos%and total Ig E level(rEos＝0.348,rIgE＝0.437,P＜0.01),and was negatively correlated with the lung function(r＝－0.745,P＜0.01).Conclusion The polymorphism of CHI3L1-rs3806448 may correlate with asthma of Han population in Guangdong area.The serum YKL-40 may be a new biomarker to evaluate asthma disease severity and helpful for monitoring illness stage.

bronchial asthma;single nucleotide polymorphism;chitotriosidase 3-like 1

R394;R562

A

2013-12-24

广东省科技厅科技计划项目资助课题(2010B031600285)

陈 敏(1976－),男,广东省兴宁市人,副主任医师,医学硕士,主要从事支气管哮喘防治的研究。

刘升明(Tel:020-38688066,E-mail:tlsm＠jnu.edu.cn)

1671-587Ⅹ(2014)05-1058-06

10.13481/j.1671-587x.20140529