大鼠龈沟液吸潮纸尖采集方法的建立及其评价

左志刚,胡 敏,刘 珊,李志敏,姜 欢,李洪发

(1.天津医科大学口腔医院正畸科,天津 300070;2.吉林大学口腔医院正畸科,吉林长春 130021; 3.天津市胸科医院心血管病研究所,天津 300051)

大鼠龈沟液吸潮纸尖采集方法的建立及其评价

左志刚1,胡 敏2,刘 珊3,李志敏1,姜 欢2,李洪发1

(1.天津医科大学口腔医院正畸科,天津 300070;2.吉林大学口腔医院正畸科,吉林长春 130021; 3.天津市胸科医院心血管病研究所,天津 300051)

目的:建立并评价大鼠龈沟液(GCF)吸潮纸尖采集方法,为大鼠龈沟液分析奠定基础。方法:选取健康雄性大鼠20只,随机分为GCF组和唾液组,每组各10只。15＃吸潮纸尖分别采集GCF组大鼠右上第一磨牙腭侧龈沟内液体和唾液组大鼠唾液。样本离心后进行SDS-PAGE分析及蛋白丰度检测,分析2组样本的蛋白成分。结果:GCF组样本电泳结果可见相对分子质量约为77 000、66 000、55 000、51 000和28 000等的蛋白质条带,尤以66 000处条带亮度最高。唾液组样本在相对分子质量约为66 000、60 000和48 000附近隐约可见蛋白质条带,条带亮度较低。2组样本66 000条带处蛋白丰度值比较差异有统计学意义(P＜0.05)。结论:GCF组样本的蛋白条带数量以及种类不同于唾液组样本,证明本实验利用15＃吸潮纸尖袋内多次取样法可排除唾液、血液干扰,成功采集大鼠GCF。

龈沟液;吸潮纸尖;蛋白分析;大鼠,Wistar

龈沟液(gingival crevicular fluid,GCF)是结缔组织内的液体不断通过龈沟内壁上皮和结合上皮进入龈沟内所形成[1],是唯一直接从体液渗出的液体。目前国内外对于GCF成分的研究多以人为研究对象,动物GCF采集分析的研究并不多见。滤纸条法是目前最常用的GCF采集方法,国内外学者[2-5]采用滤纸条法多选用Whatman 3号滤纸条作为主要材料采集动物GCF,其缺点如下:①滤纸条2 mm的宽度增加了插入牙周袋的难度;②滤纸条两直角锋利,沿牙面插入牙周袋内时,加大牙周袋内壁出血的几率,使采集的样本呈血性;③滤纸条需要手工裁剪成10 mm×2 mm规格的长方形,占用工作人员的大量时间,且精确度不佳,操作时夹持不便;④失误操作容易使GCF和唾液混淆,造成后续实验结果的不准确。

本研究结合目前研究条件,尝试利用吸潮纸尖采集大鼠GCF。吸潮纸尖是牙科专用根管清洗材料,其主要成分是棉纤维,吸水性强,60 s内吸红汞溶液迁移距离10 mm,41℃水中不分解。其相对于传统滤纸条的优点如下:①吸潮纸尖是外型具有一定锥度的圆柱体,没有两个直角尖,插入牙周袋时顺畅,不易划破袋内壁组织,且其规格齐全,其长度、锥度和直径符合国际标准,不同规格的纸尖在夹持部位用不同颜色标记。实验中可根据牙周袋口松紧和插入时坚挺的程度选择合适的型号,降低了插入牙周袋的难度;②吸潮纸尖具有良好的弹性和相当的硬度,纵向强度高,不易划破袋内壁组织,减少了采样插入牙周袋内刺破袋内壁组织造成出血的机率,去除了样本被血液污染的干扰因素;③吸潮纸尖采样操作应用效果优于Whatman 3号滤纸条,解决了操作者夹持柄问题,省去手工裁剪操作。本研究通过SDS-PAGE分析样本的蛋白成分,排除了唾液对采集样本纯度的干扰,证明所采集样本为大鼠GCF,成功建立大鼠GCF吸潮纸尖采集方法,为后续实验奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物、主要试剂和仪器20只健康雄性Wistar大鼠,体质量为(0.25±0.02)kg,由军事医学科学院实验动物中心提供(动物合格证号: 0015004)。速眠新和苏醒灵(吉林大学和平校区提供),丙烯酰胺、N,N’-亚甲双丙烯酰胺和N, N,N’,N’-四甲基二乙胺(美国Sigma公司),十二烷基硫酸钠和L-甘氨酸(北京鼎国生物技术有限责任公司),磷酸酯酶(天津市化学试剂研究所),低分子量蛋白质标准(上海生工生物工程技术服务有限公司),考马斯亮蓝R-250(长春宝泰克生物技术有限公司)。15＃吸潮纸尖(北京达雅鼎医疗器械有限公司),Mikro 22R型低温高速离心机(德国Hettich-Zentrifugen公司),HZS-H水浴振荡器(哈尔滨东联电子开发公司),DYC-242型垂直电泳槽和DYY-5型电泳仪(北京六一仪器厂),Phast Image扫描仪(Pharmacia LKB,瑞典),微量振荡器MH-1(江苏海门其林医用仪器厂),超低温冰箱(－80℃)和低温冰箱(－20℃)(日本Sanyo公司)。

1.2 实验动物分组20只健康雄性Wistar大鼠分笼喂养,自由饮水,室温控制在约25℃,随机分为GCF组和唾液组,每组10只。15＃吸潮纸尖分别采集GCF组大鼠右上第一磨牙腭侧龈沟内液体和唾液组大鼠唾液。

1.3 取 样大鼠经速眠新(0.8～1.2 m L·kg－1)肌注麻醉后仰卧固定,置开口器(图1,见插页五)。将GCF组大鼠右上磨牙颊侧以棉卷隔湿,气枪吹干受试牙面及周围牙龈黏膜,钝性牙周探针工作端背部轻压受试牙腭侧牙龈边缘,使游离龈与牙面轻微分开,将预先剪掉尖端0.5 mm并已高温高压消毒的15＃吸潮纸尖轻轻插入右上第一磨牙近、远中腭侧龈沟内至有轻微阻力即停止(约1.0 mm),留置30 s后取出,间隔1 min后重复2次,带血样本弃去,立即将纸尖密封于已消毒好的微型离心管中。15＃吸潮纸尖采集唾液组大鼠舌下区唾液,置于已高温高压消毒好的微型离心管中。

1.4 样本处理各组样本提取后,立即加入1%磷酸盐缓冲液(PBS,p H 7.2)120μL,常温下洗脱1 h,15 000 r·min－1离心5 min,提取100μL上清液,－80°保存。

1.5 SDS-PAGE分析制备凝胶,取经处理好的样本进行SDS-PAGE分析,电泳后凝胶采用考马斯亮蓝R250染色。脱色后使用硝酸银染色法对凝胶进行染色。银染色凝胶用Phast Image扫描仪进行扫描,根据标准蛋白质的迁移率测定各样本条带蛋白质亚基的相对分子质量,并进行各条带的定量分析。SDS-PAGE电泳的某一蛋白质条带的光密度(A)值与该条带面积乘积为此条带的丰度(abundance),反映该条带蛋白质的水平。

1.6 统计学分析采用SPSS 13.0统计软件对数据进行统计分析。2组样本中所含蛋白条带数和蛋白丰度以±s表示,组间比较采用t检验。

2 结果

2.1 SDS-PAGE电泳分析GCF组样本电泳结果:清晰可见相对分子质量约为77 000、66 000、55 000、51 000和28 000等的蛋白质条带,其中除28 000处蛋白质条带亮度略低外,其他条带亮度均高,尤以66 000处亮度最高,在相对分子质量为66 000～116 000范围内,可见3～4条亮度高低不等的蛋白质条带。唾液组样本电泳结果:在相对分子质量约为66 000、60 000和48 000处隐约可见蛋白质条带,条带亮度较低。见图2。

2.2 2组蛋白条带数对比分析2组样本蛋白条带数目不同,GCF组为(7.400±0.699)条蛋白带,唾液组为(3.400±0.699)条蛋白带,二者比较差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.3 2组蛋白丰度应用Phast Image扫描仪扫描各样本主要蛋白的蛋白丰度,2组样本相对分子质量66 000处蛋白的蛋白丰度比较差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

图2 GCF组和唾液组大鼠样本SDS-PAGE电泳图Fig.2 Electrophoregram of rat samples in GCF group and saliva group detected by SDS-PAGELane 1:Standard protein marker;Lane 2:GCF group;Lane 3:Saliva group.

表1 GCF组和唾液组样本蛋白丰度检测结果Tab.1 Determination results of protein abundance of samples in GCF group and saliva group(±s)

表1 GCF组和唾液组样本蛋白丰度检测结果Tab.1 Determination results of protein abundance of samples in GCF group and saliva group(±s)

∗P＜0.05 compared with GCF group.“－”:No protein bands.

Group Protein abundance 77 000 66 000 60 000 55 000 51 000 48 000 28 000 GCF 0.35±0.24 0.57±0.33 －0.34±0.28 0.37±0.23－0.26±0.21 Saliva－0.20±0.16∗0.19±0.14－－0.17±0.13－

3 讨论

口腔环境中的液体包括唾液与GCF。唾液是由涎腺分泌的,经过导管系统排入口腔,广泛存在于口腔环境中。GCF的成分与血清相近,因为其成分主要来源于血清,含有电解质、氨基酸和免疫球蛋白等,具有抗菌和增强牙龈免疫的能力。GCF的其他成分来源于细菌、牙周局部细胞产生的间质液及上皮和结缔组织的破坏产物等[6]。在牙周组织病变或改建过程中,GCF的成分可能发生微量改变[7-12]。目前国内外GCF研究[13-15]已经涉足到口腔医学各个学科,包括口腔修复科、口腔种植科、正畸科和儿科等。近年来越来越多的研究[16]发现:牙周病与全身疾病密切相关,并且由于GCF具有方便、无创和准确等优点,GCF的研究已不仅仅局限在口腔医学领域范畴,而是深入到其他临床医学之中,应用越来越广泛。

正常情况下,龈沟内存在菌斑微生物及其代谢产物,且龈沟内始终有渗透梯度的变化,故龈沟内有少量GCF聚积。GCF的采集方法一般有龈沟冲洗法、滤纸条法和微吸管法,采集方法不同,GCF的质和量亦有差异。龈沟冲洗法主要适合于研究龈沟内细胞种类的鉴定和数目及功能的分析,短时间内限定位点的龈沟彻底冲洗法可获得代表性龈沟内样本[17]。滤纸条法和微吸管法主要用于GCF的生化分析。微吸管法可定量采集较大量的GCF,但缺点是易对袋壁组织产生较大的刺激,引起毛细血管通透性增加,使GCF样本被血清稀释和“污染”[18],且此法的误差较大。滤纸条法是目前最常用的方法,该法操作方便,对组织无损伤,而且误差小,重复性好。滤纸条法又分为袋内法和袋外法,袋外法避免了滤纸插入时对龈沟上皮的物理性刺激,但获得的GCF量较少,可能导致GCF被唾液污染;袋内法较袋外法获得的GCF量多,但对局部的刺激可能导致血清稀释作用。由此可见,在采集量少的GCF时很容易被存在于整个口腔的唾液污染,所以本研究对采集样本进行蛋白分析,比较GCF组样本与唾液组样本蛋白条带数及蛋白种类,证明本实验利用吸潮纸尖在采集过程中可以排除唾液干扰,成功采集大鼠GCF。

本研究结果显示:GCF组样本蛋白条带与唾液组比较差异有统计学意义。由于蛋白质是GCF的重要成分,其来源于血浆、宿主细胞的产物、组织破坏降解产物、菌斑及其产物。唾液中99%是水,有机物主要是唾液淀粉酶、黏多糖、黏蛋白和溶菌酶等,无机物有钠、钾、钙、氯和硫氰离子等,蛋白含量很少。所以,蛋白质含量多的GCF电泳会出现较多的蛋白条带,而蛋白含量少的唾液则会出现较少的蛋白条带。SDS-PAGE结果显示: GCF组样本和唾液组样本中所含蛋白质种类也不相同。GCF组样本中可见相对分子质量约为77 000、66 000、55 000、51 000和28 000等的蛋白质条带,条带亮度较高,该结果与周华等[19]对人GCF蛋白质成分的电泳分析结果相似,且与血清蛋白质区带相一致,说明这些蛋白是GCF的主要血清蛋白质;唾液组样本在相对分子质量约为66 000、60 000和48 000处隐约可见亮度较低的蛋白质条带,GCF组样本中出现的蛋白质在唾液组样本中未检测到,而相对分子质量为60 000和48 000的蛋白质只在唾液组样本中检测到,相对分子质量为66 000的蛋白质在2组样本中均检测出, 但GCF组样本该蛋白质的蛋白丰度值高于唾液组样本。本实验结果表明:GCF组样本的蛋白质条带无论是数量还是种类显著多于唾液组样本的蛋白质条带,说明GCF组样本的蛋白质成分更复杂,由此可将二者区分,证明利用吸潮纸尖可以成功采集到未被唾液污染的大鼠GCF样本。

Johnson等[20]通过体内、体外实验证明:吸潮纸尖的吸潮性、分离洗脱的回收率和采集临床样本的检测效果均与传统滤纸条无明显差异。本实验选择15＃吸潮纸尖代替滤纸条采集GCF,在采集及贮存过程中,需注意以下几点情况:①在实验前减去吸潮纸尖尖端5 mm处以增加其前端强度;②操作须在安静、平静的状态下进行,操作者不宜紧张,采集过程中应细致、准确、谨慎;③由于大鼠口角不易完全拉开,且颊侧前庭沟软组织较多,颊侧术区视野不宜完全暴露,故本实验选择采集上颌第一磨牙腭侧近远中部位龈沟液;④GCF采集前充分干燥牙齿及周围组织,用钝性牙周探针工作端背部轻压受试牙腭侧牙龈边缘,使游离龈与牙面轻微分开,易于纸尖的插入;⑤纸尖插入至有轻微阻力即停止(约1.0 mm),留置30 s后取出,可见纸尖前端约2 mm处为透明色液体浸渍;⑥由于吸潮纸尖采集GCF量较少,且为减小第1次取样时龈沟内可能存留唾液的干扰,本实验采取多次取样法,即间隔1 min后再重复取样2次;⑦带血样本弃去;⑧本实验采用洗提法加离心法处理样本;⑨样本以PBS作为缓冲液,－80℃保存。

在以往的动物实验中,由于误操作容易使GCF和口腔中的唾液、血液等其他液体混淆,造成后续实验结果的不准确。在本实验中,取样时弃去带血样本排除了血液的干扰。

综上所述,利用15＃吸潮纸尖袋内多次取样法可以成功采集大鼠GCF,排除了唾液、血液等口腔中其他液体的干扰,为后续实验中GCF的分析奠定了基础。

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Establishment and evaluation of method to collect rat gingival crevicular fluid by using absorbent paper points

ZUO Zhi-gang1,HU Min2,LIU Shan3,LI Zhi-min1,JIANG Huan2,LI Hong-fa1
(1.Department of Orthodontics,Stomatology Hospital,Tianjin Medical University,Tianjin 300070, China;2.Department of Orthodontics,Stomatology Hospital,Jilin University,Changchun 130021,China; 3.Institute of Cardiovascular Diseases,Tianjin Chest Hospital,Tianjin 300051,China)

ObjectiveTo establish and evaluate the method to collect the rat gingival crevicular fluid(GCF)by using absorbent paper points,and to lay foundation for analysis on GCF.Methods20 healthy male rats were selected and randomly divided into GCF group and saliva group.The GCF of the right upper molar gingival trough of the rats in GCF group and the saliva of the rats in saliva group were collected by using 15＃absorbent paper points.The SDS-PAGE analysis and abundance detection were applied to analyze the protein bands of the samples in two groups.ResultsThe SDS-PAGE analysis identified the proteins at 77 000,66 000,55 000,51 000,and 28 000,especially 66 000 in GCF group.While saliva group had lower brightness protein bands at 66 000,60 000, and 48 000.The data of protein abundance of 66 000 between two groups had statistically significant difference (P＜0.05).ConclusionThe number and types of the protein bands are different between GCF Group and saliva group,so using 15＃absorbent paper points can collect the rat GCF successfully.

gingival crevicular fluid;absorbent paper points;protein analysis;rats,Wistar

R783.5

A

2013-11-27

吉林省科技厅科研基金资助课题(20080042-1);天津医科大学科学基金青年项目资助课题(2012KYQ13)

左志刚(1982－),男,河北省张家口市人,主治医师,医学硕士,主要从事口腔正畸学研究。

李洪发(Tel:022-23332097,E-mail:leehongfa＠yahoo.com.cn)

1671-587Ⅹ(2014)05-1028-05

10.13481/j.1671-587x.20140524