咪多吡对帕金森病模型大鼠黑质纹状体胶质细胞增生及活化的影响

吕超男,刘 斌,马原源,苗玉超,刘 颖,张晋霞,毛文静,孙 静,成晓华

(河北联合大学附属医院神经内一科,河北唐山 063000)

咪多吡对帕金森病模型大鼠黑质纹状体胶质细胞增生及活化的影响

吕超男,刘 斌,马原源,苗玉超,刘 颖,张晋霞,毛文静,孙 静,成晓华

(河北联合大学附属医院神经内一科,河北唐山 063000)

目的:探讨咪多吡对帕金森病(PD)模型大鼠黑质纹状体胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和整合素αM (cd11b)表达的影响,阐明咪多吡对胶质细胞的调控作用。方法:72只健康SD大鼠随机分为对照组、PD模型组(模型组)和咪多吡处理组(咪多吡组),每组24只。PD模型组和咪多吡组大鼠采用鱼藤酮制备PD模型,模型制备成功后各组大鼠随机分为4 d和8 d 2个亚组,每个亚组12只大鼠。免疫组织化学法和Western blotting法检测大鼠黑质纹状体GFAP和cd11b阳性细胞数和蛋白表达水平。结果:对照组大鼠GFAP和cd11b阳性细胞均处于静息状态,GFAP阳性细胞胞体细长不规则,有细长的突起,cd11b阳性细胞胞体较小,呈分支状,突起较细长;模型组大鼠GFAP和cd11b阳性细胞呈激活状态,GFAP阳性细胞胞体肥大,突起增多增粗,cd11b阳性细胞胞体增大,突起变粗变短,数量增多;与模型组比较,咪多吡组大鼠GFAP阳性细胞胞体及突起较细长, cd11b阳性细胞胞体较小,突起较细长,数量减少。对照组大鼠黑质纹状体可见少量的GFAP和cd11b阳性细胞表达,8 d组与4 d组比较差异无统计学意义(P＞0.05);模型组大鼠GFAP和cd11b阳性细胞数和蛋白表达水平均明显增加,与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.01),且8 d组多于4 d组,但差异无统计学意义(P＞0.05);咪多吡组大鼠GFAP和cd11b阳性细胞数和蛋白表达水平均明显降低,与模型组比较差异均有统计学意义(P＜0.01),且8 d组少于4 d组,2组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。结论:PD模型大鼠黑质纹状体胶质细胞明显增生和活化,咪多吡能够抑制胶质细胞的增生和活化。

帕金森病;胶质细胞;胶质纤维酸性蛋白;整合素超家族成员Ⅰ型跨膜蛋白;咪多吡

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一种多因素综合作用的中枢神经系统变性疾病,在遗传背景、环境暴露和老龄化的共同作用下,氧化应激、线粒体功能衰竭、钙稳态失衡、兴奋性氨基酸毒性和细胞凋亡等机制导致黑质纹状体多巴胺能神经元大量变性缺失[1]。研究[2]表明:炎症反应在PD的多巴胺(dapamine,DA)能神经元死亡的过程中起着重要作用。胶质细胞是炎症反应的重要参与者,其活化后可产生多种促炎因子,如白细胞介素1 (IL-1)、白细胞介素6(IL-6)、巨噬细胞炎症蛋白、单核细胞趋化蛋白1和肿瘤坏死因子α(TNF-α) 等,多种促炎因子损伤了DA能神经元,在PD的发病机制中起着重要作用[3]。因此,抑制胶质细胞的增生和活化可能成为阻止PD发展的一条途径[4]。胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)的表达情况可反映星形胶质细胞的增生与活化,是星形胶质细胞的特异性标记物[5]。整合素αM(cd11b)对炎症细胞迁移和功能具有重要作用,CD11b的阳性表达能反映小胶质细胞的增生与活化[6],是小胶质细胞的特异性蛋白标记物[7]。咪多吡(eldepryl)是一种常用的单胺氧化酶B抑制剂,能保护黑质细胞免于各种神经毒素的侵害而阻止PD进展,具有神经保护作用[8],但具体作用机制尚不明确。本研究采用颈背部皮下注射鱼藤酮制备大鼠PD模型,探讨PD模型大鼠黑质纹状体GFAP和cd11b的表达情况及咪多吡对其表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物、主要试剂和仪器清洁级健康雄性SD大鼠,体质量250～300 g,购于北京华阜康生物科技股份有限公司,合格证号SCXK(京) 2012-0013,在河北联合大学屏障环境动物实验室自由进食喂养,室温控制在(23±2)℃,自然光照,实验前适应喂养2周。咪多吡(成分:盐酸司来吉兰),批号H20040400,规格5 mg/片,芬兰Orion Corporation Espoo公司产品。鱼藤酮、葵花油、兔抗大鼠GFAP抗体、兔抗大鼠cd11b抗体和免疫组织化学试剂盒(SP-0023)均购自北京博奥森生物工程有限公司,DAB显色液购自北京中杉生物有限公司,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳低分子量标准蛋白购自华美生物公司。低温离心机购自美国Sigma公司。

1.2 动物分组72只健康SD大鼠随机分为对照组、PD模型组(模型组)和咪多吡处理组(咪多吡组)。每组又分为模型制备成功后4 d和8 d 2个亚组,每个亚组各12只大鼠(其中6只用于免疫组织化学法检测,6只用于Western blotting法检测)。

1.3 动物模型制备采用颈背部皮下注射鱼藤酮制备大鼠PD模型[9]。具体操作方法:鱼藤酮以葵花油配制成乳液,充分震荡混匀后避光保存。模型组和咪多吡组大鼠称体质量后以鱼藤酮2 mg·kg－1计算鱼藤酮葵花油乳液用量。捏起大鼠颈背部皮肤,用1 m L注射器皮下注射鱼藤酮葵花油乳液。对照组大鼠皮下注射葵花油。将大鼠行为变化分6个等级记分[10]:1分,大鼠出现拒捕行为减弱、竖毛、毛色变黄变脏、弓背和主动活动减少;2分,有1分的表现,且主动活动减少明显、动作迟缓,并有震颤,或有步态不稳;4分,有2分的表现,且步态不稳,或不能直线行走、或行步时向一侧旋转;6分,向单侧斜卧,单侧前肢和(或)后肢瘫痪,行走困难、进食困难;8分,单侧前肢和(或)后肢完全瘫痪,四肢拘挛,质量大幅度减轻,不能进食;10分,濒死状态或死亡。本实验选取2～6分大鼠入选PD模型。未符合入选标准大鼠随时被替换,并重新制备模型大鼠到相应组别。本实验造模后大鼠出现震颤、僵直、运动减少、活动迟缓和行步时向一侧旋转等行为学改变,说明造模成功。

1.4 给药方法对照组:大鼠连续颈背部皮下注射葵花油2 mg·kg－1,待模型制备成功后停止皮下注射,并灌胃给予生理盐水。模型组:大鼠连续颈背部皮下注射鱼藤酮葵花油乳液2 mg·kg－1,待模型制备成功后停止皮下注射,并灌胃给予生理盐水。咪多吡组:模型制备成功后,每日灌胃给予咪多吡0.5 mg·kg－1,分别连续给药4和8 d。

1.5 标本制备和检测方法免疫组织化学法:用10%水合氯醛(4 m L·kg－1)腹腔麻醉动物,于剑突下剪一约2～3 cm横切口,沿膈肌与胸廓交界处剪开膈肌,向上剪断3根肋骨,暴露心脏,剪开右心耳,经心脏快速灌注生理盐水100～200 m L (4℃)至肝脏完全变白,之后灌入含4%多聚甲醛的0.1 mol·L－1PBS(p H 7.4,4℃)200～400 m L,至大鼠肝脏变硬、肢体僵直,即固定完成。然后完整取出鼠脑置于含4%多聚甲醛的0.1 mol·L－1PBS(p H 7.4,4℃)中过夜固定保存。参照《大鼠脑立体定位图谱》[11]在大鼠黑质纹状体取材,进行常规脱水、石蜡包埋。选择4μm厚度连续切片,捞片后置于60℃烤箱中烘干0.5 h。取各组制备好的黑质纹状体组织切片,加入正常羊血清封闭液中,分别滴加兔抗大鼠GFAP一抗(1∶200)和兔抗大鼠cd11b一抗(1∶200)4℃过夜,滴加二抗和适量辣根酶标记链霉卵白素工作液,进行DAB显色。按试剂盒说明书操作要求检测各组大鼠黑质纹状体中GFAP和cd11b蛋白表达。光镜下观察,胞浆呈棕黄色、核呈浅蓝色或紫蓝色为阳性细胞。高倍镜下观察阳性细胞形态变化,并随机分别观察各组大鼠黑质纹状体不重叠的6视野,进行GFAP和cd11b阳性细胞计数。Western blotting法:用10%水合氯醛(0.3 m L·100 g－1)对大鼠进行深度麻醉。断头后立即分离出新鲜黑质纹状体,制取蛋白样品。取等量的样品进行电泳、转膜、封闭后, 在GFAP蛋白(48 000)和cd11b蛋白(125 000)相对分子质量相应位置处剪取PVDF膜,分别加入稀释好的兔抗大鼠GFAP一抗(1∶1 000)和兔抗大鼠cd11b一抗(1∶250),4℃孵育过夜,PBS洗膜,

1.6 统计学分析采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析。各组大鼠黑质纹状体中GFAP和CD11b阳性细胞数及蛋白表达水平以±s表示,组间比较采用单因素方差分析,2组间均数比较采用t检验。

2 结果

2.1 各组大鼠黑质纹状体中GFAP和cd11b阳性细胞数对照组大鼠黑质纹状体可见少量的GFAP 和cd11b阳性细胞表达,GFAP和cd11b阳性细胞均处于静息状态,GFAP阳性细胞胞体细长不规则,有细长的突起,cd11b阳性细胞胞体较小,呈分支状,突起较细长;且GFAP和cd11b阳性细胞数8 d组与4 d组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。模型组大鼠黑质纹状体中GFAP和CD11b阳性细胞数明显增多,GFAP和cd11b阳性细胞呈激活状态,GFAP阳性细胞胞体肥大,突起增多增粗,cd11b阳性细胞胞体增大,突起变粗变短,数量增多;GFAP和cd11b阳性细胞数与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.01),且8 d组多于4 d组,但差异无统计学意义(P＞0.05)。咪多吡组黑质纹状体中GFAP和cd11b阳性细胞数明显减少,与模型组比较差异均有统计学意义(P＜0.01);且GFAP和cd11b阳性细胞数8 d组少于4 d组,差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1和图1～2(插页二和三)。

2.2 各组大鼠黑质纹状体中GFAP和cd11b蛋白表达水平对照组大鼠黑质纹状体中GFAP和cd11b蛋白表达水平较低,且8 d组与4 d组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。模型组大鼠黑质纹状体中GFAP和cd11b表达水平明显增加,与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.01);虽8 d组高于4 d组,但差异无统计学意义(P＞0.05)。咪多吡组大鼠黑质纹状体中GFAP和cd11b蛋白表达水平明显降低,与模型组比较差异均有统计学意义(P＜0.01);且8 d组低于4 d组, 2组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。见表2和图3～4。加人相应稀释好的二抗(羊抗兔,1∶2 000),37℃反应1 h,洗膜,以ECL显色,胶片曝光显影,将曝光胶片的图像输入计算机,用Image J图像程序分析软件分析目的蛋白及内参的光密度(A)值,以两者的比值反映目的蛋白的相对表达量。

表1 各组大鼠黑质纹状体中GFAP和cd11b阳性细胞数Tab.1 Number of cells with positive expression of GFAP and cd11b in substantia nigra and striatum of rats in varions groups (n＝6,±s)

表1 各组大鼠黑质纹状体中GFAP和cd11b阳性细胞数Tab.1 Number of cells with positive expression of GFAP and cd11b in substantia nigra and striatum of rats in varions groups (n＝6,±s)

∗P＜0.05,∗∗P＜0.01 compared with control group;△P＜0.01 compared with model group;＃P＜0.05 compared with 4 d group.

Group GFAP cd11b (t/d) 4 848 Control 13.67±2.94 13.83±2.86 29.50±3.83 30.17±1.94 Model 30.83±3.06∗∗31.67±3.20∗∗62.33±3.07∗∗65.67±4.58∗∗Eldepryl 21.00±2.53∗∗△17.50±2.07∗△＃46.50±3.15∗∗△42.00±2.37∗∗△＃

表2 各组大鼠黑质纹状体中GFAP和cd11b蛋白表达水平Tab.2 Expression levels of GFAP and cd11b in substantia nigra and striatum of rats in varions groups(n＝6,±s)

表2 各组大鼠黑质纹状体中GFAP和cd11b蛋白表达水平Tab.2 Expression levels of GFAP and cd11b in substantia nigra and striatum of rats in varions groups(n＝6,±s)

∗P＜0.01 compared with control group;△P＜0.01 compared with model group;＃P＜0.05 compared with 4 d group.

Group GFAP cd11b (t/d) 4 848 Control 16 755.17±484.60 16 852.67±407.63 15 303.00±637.22 15 948.50±410.87 Model 28 842.83±730.72∗29 614.17±1026.23∗26 512.67±459.31∗27 159.33±649.06∗Eldepryl 26 113.17±765.60∗△25 304.83±472.87∗△＃20 996.50±565.03∗△20 323.00±574.94∗△＃

图3 Western blotting法检测各组大鼠黑质纹状体中GFAP蛋白表达电泳图Fig.3 Electrophoregram of expressins of GFAP in substantia nigra and striatum of rats in varions groups detected by Western blotting methodA:Control group;B:Model group;C:Eldepryl group.Lane 1:4 d;Lane 2:8 d.

图4 Western blotting法检测各组大鼠黑质纹状体中cd11b蛋白表达电泳图Fig.4 Electrophoregram of expressions of cd11b in substantia nigra and striatum of rats in varions groups detected by Western blotting methodA:Control group;B:Model group;C:Eldepryl group.Lane 1:4 d;Lane 2:8 d.

3 讨论

目前已经建立的PD动物模型种类较多,采用低剂量颈背部皮下注射鱼藤酮方法制备PD动物模型能较好地模拟PD的慢性进行性自然病程和发病特点,是目前国内外公认的理想的PD动物模型之一[12]。

PD主要的病理特征是脑黑质DA能神经元进行性变性丧失,炎症反应在PD的DA能神经元死亡的过程中起着重要作用[2]。胶质细胞是炎症反应的重要参与者,激活的星形胶质细胞释放一氧化氮(NO)、合成TNF-α、合成兴奋性氨基酸等发挥细胞毒性作用,造成细胞损伤,促进炎症反应和脱髓鞘,破坏血脑屏障,导致神经元的损伤[3]。激活的小胶质细胞产生大量炎性因子和氧自由基发挥神经毒性作用[13],DA能神经元对这些炎症因子和氧化物具有易感性而造成损伤[14]。死亡的DA能神经元又可以促进小胶质细胞的活化,如此形成恶性循环,使神经退行性病变进行性发展[15]。GFAP是星形胶质细胞的特征性标记物,是中枢神经系统中星形胶质细胞最常见的特征性反应之一[4]。当机体受到某种刺激时,中枢神经系统某些部位的星形胶质细胞出现GFAP的阳性表达,反映出星形胶质细胞在此时的功能活动增强。cd11b对于炎症细胞迁移和功能具有重要的作用,cd11b是小胶质细胞的特异性蛋白标记物[7]。咪多吡是一种选择性的单胺氧化酶B抑制剂,能增加抗氧化酶的浓度、减轻细胞凋亡和产生神经营养因子,保护黑质细胞免于各种神经毒素的侵害[16],在临床应用中显示出较好的治疗效果和耐受性[17]。本研究中免疫组织化学法和Western blotting法检测结果均显示:模型组大鼠黑质纹状体中GFAP与cd11b表达均增多,细胞呈激活状态,说明PD模型大鼠黑质纹状体有明显的胶质细胞增生和活化;咪多吡组大鼠黑质纹状体中GFAP与cd11b表达均减少,说明咪多吡能够抑制胶质细胞的增生和活化,且随着时间的延长,作用更明显。

综上所述,PD模型大鼠黑质纹状体有明显的胶质细胞增生和活化,咪多吡能够抑制胶质细胞的增生和活化,通过抗炎作用,对DA能神经元产生保护作用。药物干预胶质细胞激活将有助于阻止PD的进展。

[1]方 芳,丁健青.小胶质细胞异常激活在帕金森病发病中的作用及潜在临床应用[J].中国现代神经疾病杂志,2013, 13(2):153-156.

[2]Pessoa Rocha NL,Reis HJ,van den Berghe P,et al.Depression and cognitive impairment in Parkinson’s disease: a role for inflammation and immunomodulation[J].Neuroimmunomodulation,2014,21(2/3):88-94.

[3]Long-Smith CM,Sullivan AM,Nolan YM.The influence of microglia on the pathogenesis of Parkinson’s disease[J].Prog Neurobiol,2009,89(3):277-287.

[4]Weinreb O,Amit T,Saqi Y,et al.Genomic and proteomic study to survey the mechanism of action of the anti-Parkinson’s disease drug,rasagiline compared with selegiline,in the rat midbrain[J].Neural Transm,2009, 116(11):1457-1472.

[5]黄海东,顾建文,赵 凯.偏侧PD猴模型黑质和纹状体GFAP表达的变化[J].中国神经免疫学和神经病学杂志, 2007,14(3):130-132.

[6]Mika J,Wawrzczak-Bargiela A,Osikowicz M.Attenuation of morphine tolerance by minocycline and pentoxifylline in naive and neuropathic mice[J].Brain Behav Immun,2009, 23(1):75-84.

[7]Maolood N,Meister B.Protein components of the bloodbrain barrier(BBB)in the brainstem area postrema-nucleus tractus solitarius region[J].J Chem Neuroanat,2009, 37(3):182-195.

[8]Zhao Q1,Cai D,Bai Y.Selegiline rescues gait deficits and the loss of dopaminergic neurons in a subacute MPTP mouse model of Parkinson’s disease[J].Int J Mol Med,2013, 32(4):883-891.

[9]常宇涛,罗晓光,任 艳,等.鱼藤酮损伤大鼠黑质至行为学及黑质多巴胺能神经元损伤[J].解剖科学进展,2011, 17(1):60-62.

[10]陈 忻,张 楠,赵 晖,等.鱼藤酮致帕金森病大鼠行为学与黑质病理损伤的关系[J].中国神经精神疾病杂志, 2008,34(4):232-234.

[11]包新民,舒斯云.大鼠脑立体定位图谱[M].北京:人民卫生出版社,1990:25-28.

[12]张海娜,胡国华,陈秋惠,等.帕金森病细胞模型的建立及鱼藤酮对多巴胺神经元的毒性作用[J].吉林大学学报:医学版,2007,33(5):811-814.

[13]陆明佳,王珊珊,朱 沂.小胶质细胞介导帕金森病小鼠的氧化应激损伤[J].中国组织工程研究,2013,17(11): 2001-2006.

[14]Kim SU,de Vellis J.Microglia in health and disease[J].J Neurosci Res,2005,81(3):302-313.

[15]Gao HM,Hong JS.Why neurodegenerative diseases are progressive:uncontrolled inflammation drives disease progression[J].Trends Immunol,2008,29(8):357-365.

[16]沈鸿雁,徐赫男,胡 春.用于帕金森病治疗的单胺氧化酶B抑制剂的临床评述[J].中国药物化学杂志,2011, 21(6):483-488.

[17]Robottom B J.Efficacy,safety,and patient preference of monoamine oxidase B inhibitors in the treatment of Parkinson’s disease[J].Patient Prefer Adherence,2011, 20(5):57-64.

Influence of eldepryl in proliferation and activation of gliacytes in substantia nigra and striatum in rats with Parkinson’s disease

LYU Chao-nan,LIU Bin,MA Yuan-yuan,MIAO Yu-chao,LIU Ying,ZHANG Jin-xia, MAO Wen-jing,SUN Jing,CHENG Xiao-hua
(First Department of Neurology,Affiliated Hospital,Hebei United University,Tangshan 063000,China)

ObjectiveTo discuss the influence of eldepryl on the expressions of glial fibrillary acidic protein(GFAP) and cd11b in substantia nigra and striatum in the rats with Parkinson’s disease(PD),and to clarify the regulatory role of eldepryl in the gliacytes.Methods72 SD rats were randomly divided into control group,PD model group and eldepryl group,and each group was divided randomly into 4 d and 8 d subgroups(n＝12)after the success of model preparation.The PD rat models were established by injecting rotenone in subcutaneous.The number of GFAP and cd11b positive cells and the expressions of GFAP and cd11b were detected by immunohistochemistry and Western blotting method.ResultsThe GFAP and cd11b positive cells were all in a resting state in control group, the GFAP-positive cell body was slender and irregular and had elongated protrusions;the cd11b-positive cell body was small and branch-like,and it had more slender protrusions.The GFAP and cd11b positive cells were all in a active state in model group,the GFAP-positive cell body was hypertrophy,the projections increased thickening;the cd11b-positive cell body was more bigger,the projections were shorter and thicker,and the number was increased.Compared with model group,the GFAP-positive cell body and protrusions were more slender,the CD11b-positive cell body was more smaller,the projections were more slender,and the number was decreased in eldepryl group.There were a small amount of expression of GFAP and cd11b positive cells in substantia nigra and striatum in the rats in control group,and there was no significant difference between 8 d group and 4 d group(P＞0.05).The number of GFAP and cd11b positive cells and the protein expression levels were significantly increased in model group compared with control group(P＜0.01);there was more expression in 8 d group compared with 4 d group,but there was no significant difference(P＞0.05).The number of GFAP and cd11b positive cells and the protein expression levels in eldepryl group were significantly reduced compared with model group(P＜0.01);there were less expression in 8 d group compared with 4 d group,and there was significant difference(P＜0.05).ConclusionThere are activation and proliferation of the gliacytes in substantia nigra and striatum in the rats with PD,and eldepryl can inhibit the activation and proliferation of gliacytes.

Parkinson’s disease;gliacytes;glial fibrillary acidic protein;cd11b;eldepryl

R742.5

A

2013-12-29

河北省卫生厅医学科学研究重点项目资助课题(20130064)

吕超男(1986－),女,河北省任丘市人,医师,医学硕士,主要从事神经变性疾病的基础与临床研究。

刘 斌(Tel:0315-3725963,E-mail:liubintsh＠126.com)

1671-587Ⅹ(2014)05-0953-05

10.13481/j.1671-587x.20140509