DAB2IP基因慢病毒载体构建及其在前列腺癌PC3细胞中的表达

华 兴,潘文海

(1.暨南大学第四附属医院广州市红十字会医院病理科,广东广州 510515;2.暨南大学第四附属医院广州市红十字会医院泌尿外科,广东广州 510515)

DAB2IP基因慢病毒载体构建及其在前列腺癌PC3细胞中的表达

华 兴1,潘文海2

(1.暨南大学第四附属医院广州市红十字会医院病理科,广东广州 510515;2.暨南大学第四附属医院广州市红十字会医院泌尿外科,广东广州 510515)

目的:构建重组慢病毒质粒pSin-EF2-Puro-DAB2IP并转染前列腺癌PC3细胞,观察其转染效率及其在PC3细胞中的表达。方法:以人前列腺癌PC3细胞基因组cDNA为模板PCR扩增获得目的基因DAB2IP片段后,应用基因重组技术将目的片段克隆到PC3-pSin慢病毒表达载体,经PCR、双酶切和测序鉴定后,重组慢病毒表达质粒和包装质粒共转染293FT细胞,获得携带DAB2IP基因的重组慢病毒。取病毒上清感染人前列腺癌PC3细胞,以PC3-pSin-EF2为对照,分别采用RT-QPCR、Western blotting法检测DAB2IP在靶细胞中的表达水平。结果:重组慢病毒质粒pSin-EF2-Puro-DAB2IP经PCR、EcoRⅠ和NheⅠ双酶切鉴定结果与目的基因条带吻合,克隆测序结果与NCBI收录的DAB2IP基因序列(NM_138709)完全一致。重组慢病毒质粒转染293FT细胞收获慢病毒上清可高效感染PC3细胞,对照组细胞株PC3-pSin-EF2及过表达细胞株PC3-pSin-EF2-DAB2IP 内DAB2IP基因的相对拷贝数分别为0.001±0.000和0.158±0.013,与对照组细胞比较,过表达细胞内DAB2IP基因mRNA表达水平上调(179.37±15.89)倍,差异有统计学意义(P＜0.001);Western blotting法,对照组PC3-pSin-EF2细胞中DAB2IP蛋白表达水平为内参的(1.002±0.783)倍,PC3-pSin-EF2-DAB2IP细胞组为内参的(2.431±0.892)倍,过表达组DAB2IP蛋白表达水平为对照组的(2.415±0.961)倍,差异有统计学意义(P＜0.01)。结论:成功构建携带DAB2IP基因的慢病毒表达载体pSin-EF2-Puro-DAB2IP,并使目的基因在靶细胞中稳定表达,为进一步研究DAB2IP基因的相关功能提供了优质的稳定转染载体。

DAB2IP;慢病毒载体;前列腺肿瘤

前列腺癌是常见的泌尿系统恶性肿瘤之一,其发生发展涉及到一系列癌基因及抑癌基因的改变[1]。DAB2IP(DOC2/DAB2 interaction protein)基因是一种新发现的抑癌基因,参与细胞的信号转导,影响细胞的生长发育和凋亡[2-3]。近来研究[4-5]发现:DAB2IP在多种恶性肿瘤的发生发展过程中表达下调,因而引起人们的关注。但DAB2IP在前列腺癌发生发展中的具体功能及作用机制尚不清楚。本研究构建携带DAB2IP基因的重组慢病毒载体,感染人前列腺癌PC3细胞,并使DAB2IP基因在靶细胞中稳定表达,旨在为进一步研究DAB2IP基因的相关功能提供优质的稳定转染载体。

1 材料与方法

1.1 细胞和主要试剂人前列腺癌PC3细胞购自中山大学医学实验中心,293FT细胞购自美国Invitrogen公司,均为贴壁细胞;DH5α感受态细胞购自天根生化科技有限公司;cDNA表达载体pSin-EF2及包装载体pSPAX、p MD2G购自美国Promega公司,Eco RⅠ、NheⅠ内切酶、质粒小量抽提试剂盒、质粒大提取试剂盒、胶回收试剂盒、Taq酶和DNA相对分子质量标准均购自日本Takara公司,LipofectamineTM2000、Opti-MEM培养基购自美国Invitrogen公司,0.45μm PVDF膜为美国Millipore公司产品,DAB2IP多克隆抗体、β-actin单克隆抗体均购自英国Abcom公司,其他常规化学试剂购于广州威佳科技有限公司。

1.2 引物设计与合成根据NCBI DAB2IP基因序列(NCBI登录号为NM_138709)全长设计合成引物:DAB2IP-F,5′-CCGGAATTCATGCCGAGGCTGAAGGAGTC-3′(Eco RⅠ);DAB2IP-R, 5′-CTAGCTAGCTTAACAATTGCTGCTGTTTCTGAACT-3′(NheⅠ),上、下游引物5′端加上Eco RⅠ和NheⅠ2个酶切位点及保护碱基,引物经BLAST软件特异性分析,由美国Invitroigen公司合成。

1.3 重组慢病毒表达载体pSin-EF2-Puro-DAB2IP的构建以PC3细胞基因组cDNA为模板,进行PCR反应。反应完毕后行0.8%低熔点琼脂糖凝胶电泳,切胶回收DAB2IP目的片段,用限制性内切酶Eco RⅠ和NheⅠ分别双酶切,切胶回收目的片段和提取pSin-EF2质粒,回收酶切产物,将纯化后的双酶切产物采用Takara的快速连接酶, 16℃连接30 min,连接后命名为pSin-EF2-Puro-DAB2IP。重组质粒转化感受态大肠杆菌DH5α,随机挑取数个中等偏小偏圆的白色单克隆菌落,分别摇菌过夜,经PCR和酶切鉴定,阳性克隆送华大基因公司进行测序。

1.4 慢病毒包装制备培养293FT细胞,并于转染前1 d接种到直径10 cm培养皿,当细胞长至80%饱和度时,将慢病毒表达载体pSin-EF2或pSin-EF2-Puro-DAB2IP分别与辅助质粒pSPAX 和p MD2G混合后,加入30μL Lipofectamine 2000阳离子脂质体,共转染293FT包装细胞,转染10 h后,更换完全培养基(含10%FBS的DMEM),并在37℃、5%CO2培养箱中培养48 h,收集上清液,3 000 r·min－1离心5 min,经0.45μm PVDF膜过滤,分装后冻存于－80℃备用。

1.5 慢病毒感染人前列腺癌细胞PC3转染前1 d 将PC3细胞接种至24孔板中,每孔2×105个细胞,使培养细胞达到80%～85%汇合。去除孔内的培养基,将含病毒的完全培养基加入细胞培养孔中,病毒感染的同时加入工作液浓度为5 g·L－1的聚凝胺(polybrene)以增加感染效率,每12 h重复感染1次,共感染3次,感染完毕后换为1 m L的完全培养基过夜;之后加入嘌呤霉素(pruomyein,Puro)(0.5 mg·L－1)抗性筛选获得PC3-psin-EF2和PC3-psin-EF2-DAB2IP稳定株细胞。

1.6 感染后鉴定维持抗性浓度的Puro培养液扩增稳定感染的PC3-pSin-EF2和PC3-pSin-EF2-DAB2IP细胞,以每孔5×105个细胞接种于6孔板,24 h后收集稳定细胞株的RNA及蛋白质,进行RT-QPCR及Western blotting法检测。

1.7 RT-QPCR检测DAB2IP m RNA表达水平每孔加入1 m L Trizol提取细胞总RNA,采用核酸分光光度仪定量及测定其纯度,应用MMLVRT逆转录酶合成c DNA,使用普通PCR反应进行条件探索及优化,SYBR Premix Ex Taq Kit进行QPCR检测DAB2IP m RNA表达情况。其中β-actin作为内参,所需引物序列如下:DAB2IP-F, 5′-AGCTGGAGCAGAGCAT AGTA-3′,DAB2IP-R, 5′-GGTGTGGAGGCCAGGTCATT-3′,扩增产物124 bp;β-actin-F,5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′,β-actin-R,5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′,扩增产物186 bp(下划线为酶切位点)。检测指标:目的基因m RNA相对拷贝数(DAB2IP基因与内参基因的表达差异倍数)及实验组与对照组DAB2IP的表达差异倍数。

1.8 Western blotting法检测DAB2IP蛋白表达水平收集PC3-pSin-EF2和PC3-pSin-EF2-DAB2IP细胞,采用1 m L预冷PBS洗涤2次,加入全蛋白裂解液后冰上裂解10 min。枪头吹打以充分裂解细胞后提取总蛋白,经BCA法检测蛋白浓度后行12%SDS-PAGE电泳分离,电转移至PVDF膜上, 将PVDF膜浸入5%脱脂奶粉/TBST,室温摇床缓慢摇动,封闭60 min,DAB2IP一抗4℃孵育过夜(1∶3 000稀释)、β-actin二抗37℃孵育1 h (1∶6 000稀释),加入凯基超敏型ECL检测液进行发光,在暗室中行压片、显影和定影。结果以培清凝胶成像分析系统拍照,条带灰度分析软件Image J分析DAB2IP蛋白的表达水平(目标蛋白条带与内参条带灰度的比值。

1.9 统计学分析采用SPSS 20.0软件对数据进行统计学处理。DAB2IP m RNA和蛋白相对表达水平以±s表示,组间比较采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 目的片段获得以PC3细胞基因组cDNA为模板PCR获得目的基因DNA后,进行琼脂糖凝胶电泳,可见3 216 bp明亮特异的目的条带(图1),大小与理论值一致。

2.2 重组慢病毒表达载体pSin-EF2-Puro-DAB2IP的鉴定目的基因片段经胶回收连接于pSin-EF2慢病毒载体,挑取菌落PCR鉴定阳性的单克隆进行培养,重组质粒经限制性内切酶Eco RⅠ和NheⅠ进行双酶切后,获得约7 500和3 216 bp的条带(图2),与理论值大小一致,表明DAB2IP插入pSin-EF2载体中。将鉴定出的阳性克隆送于华大基因公司进行测序,测序结果与GenBank中DAB2IP基因(NCBI,NM_138709)标准序列一致(图3),说明重组慢病毒质粒pSin-EF2-Puro-DAB2IP构建成功。

图1 PCR扩增目的基因DAB2IP的电泳图Fig.1 Electrophoregram of DAB2IP gene amplified by PCRM:Marker DL 5000;Lane 1:DAB2IP.

图2 重组质粒经Eco RⅠ和NheⅠ双酶切鉴定的电泳图Fig.2 Electrophoregram of identification of recombinant plasmid digested by Eco RⅠand NheⅠM:Marker DL 5000;Lane 1－3:Positive clones.

图3 经酶切鉴定阳性克隆菌液测序结果Fig.3 Sequencing results of positive clones identified by enzyme digestion liquid

2.3 RT-QPCR检测DAB2IP mRNA表达慢病毒感染PC3细胞后加入Puro(0.5 mg·L－1)抗性筛选获得PC3-pSin-EF2和PC3-pSin-EF2-DAB2IP稳定株细胞。提取RNA后行RT-QPCR检测DAB2IP m RNA表达情况。与对照组细胞PC3-pSin-EF2比较,PC3-pSin-EF2-DAB2IP组细胞内DAB2IP基因表达水平上调(179.37± 15.89)倍(P＜0.001)。见表1。

表1 RT-QPCR检测慢病毒感染PC3细胞后DAB2IP m RNA表达水平Tab.1 Expression levels of DAB2IP mRNA in PC3 cells after infected with lentivirus detected by RT-PCR

2.4 Western blotting法检测DAB2IP蛋白表达收集PC3-pSin-EF2和PC3-pSin-EF2-DAB2IP细胞裂解液作为样本,Western blotting法检测DAB2IP蛋白表达情况。DAB2IP蛋白相对分子质量为118 000(图2),经条带灰度分析软件测量显示:对照组PC3-pSin-EF2细胞DAB2IP蛋白表达水平为内参的(1.002±0.783)倍,PC3-pSin-EF2-DAB2IP细胞组为内参的(2.431± 0.892)倍,PC3-pSin-EF2-DAB2IP组DAB2IP蛋白表达水平为对照组的(2.415±0.961)倍,后2组与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01),提示成功建立DAB2IP稳定过表达细胞株。

图4 Western blotting法检测慢病毒感染PC3细胞后DAB2IP蛋白表达电泳图Fig.4 Electrophoregram of expression of DAB2IP protein in PC3 cells after infected with lentivirus detected by Western blotting methodLane 1:Vector;Lane 2:DAB2IP.

3 讨论

细胞基因转染有多种载体可供选择,如质粒、脂质体、反转录病毒和腺病毒等,其中慢病毒载体作为一类来源于逆转录病毒的载体,以其转染效率高、可感染分裂期和非分裂期细胞、容纳外源性基因片段大等优点,在科研领域有着良好的发展前景[6-7]。慢病毒载体不仅能将目的基因整合到宿主细胞染色体中,长期稳定表达外源基因,还可为活体动物模型实验提供高质量的包含目的基因的病毒液,产生转基因动物,慢病毒载体是目前理想的基因治疗载体系统[8-9]。

DAB2IP是Ras GTPase-activating protein (Ras GAP)家族的新成员,其与DAB2/DOC2蛋白的N末端结合,是DAB2信号途径的下游效应器;而DAB2是重要的肿瘤抑制基因,在多种肿瘤的发生中发挥作用[10-11]。DAB2IP作为一种新的GTPase激活蛋白,是Ras和肿瘤坏死因子介导的凋亡通路等多条信号通路中的重要环节,广泛参与细胞内多条信号通路的转导,如MAPK/ERK、ASK1-JNK、PI3K-AKT和NF-κB信号通路等,其能结合到肿瘤抑制蛋白DOC2/DAB2的N端,介导DAB2信号通路的下游效应,从而发挥其肿瘤抑制作用[3,12-13]。

DAB2IP表达下调和抑癌功能丧失与多种肿瘤的发生发展有关,如前列腺癌、乳腺癌、胃癌、结直肠癌和肺癌等[13-14]。Chen等[15]发现:人正常前列腺上皮细胞有DAB2IP基因表达,而在前列腺癌细胞DAB2IP基因表达缺失或下调。研究[16]显示:在前列腺癌组织中DAB2IP启动子区域高甲基化,该区域及附近区域Cp G岛胞嘧啶的甲基化可在转录水平调节基因的表达,引起相应的基因沉默,而去甲基化处理后又可使其恢复表达。

DAB2IP作为重要的抑癌基因,对该基因的进一步研究将为肿瘤的诊断和治疗提供新途径,有望成为治疗肿瘤的突破口之一。本实验成功构建携带DAB2IP基因的慢病毒表达载体pSin-EF2-Puro-DAB2IP,并使DAB2IP基因在前列腺癌PC3细胞中稳定表达,为进一步研究DAB2IP基因的相关功能提供了优质的稳定转染载体。

[1]Perry AS.Prostate cancer epigenomics[J].J Urol,2013, 189(1):10-11.

[2]Wu K,Liu J,Tseng SF,et al.The role of DAB2IP in androgen receptor activation during prostate cancer progression[J].Oncogene,2014,33(15):1954-1963.

[3]Chen H,Karam JA,Schultz R,et al.Cloning of mouse Dab2ip gene,a novel member of the RasGTPase-activating protein family and characterization of its regulatory region in prostate[J].DNA Cell Biol,2006,25(4):232-245.

[4]Wu K,Xie D,Zou Y,et al.The mechanism of DAB2IP in chemoresistance of prostate cancer cells[J].Clin Cancer Res, 2013,19(17):4740-4749.

[5]Qiao S,Kim SH,Heck D,et al.Dab2IP GTPase activating protein regulates dendrite development and synapse number in cerebellum[J].PLoS One,2013,8(1):e53635.

[6]吴海霞,张维铭,李晓眠.基因转染技术的发展与现状[J].国际生物医学工程杂志,2007,30:376-379.

[7]Thrasher AJ.Progress in lentiviral vector technologies[J].Hum Gene Ther,2013,24(2):117-118.

[8]Saenz DT,Barraza R,Loewen N,et al.Titration of feline immunodeficiency virus-based lentiviral vector preparations[J].Cold Spring Harb Protoc,2012, 2012(1):126-128.

[9]Witting SR,Li LH,Jasti A,et al.Efficient large volume lentiviral vector production using flow electroporation[J].Hum Gene Ther,2012,23(2):243-249.

[10]Harrison SC,Cooper JA,Li K,et al.Association of a sequence variant in DAB2IP with coronary heart disease[J].Eur Heart J,2012,33(7):881-888.

[11]Duan YF,Li DF,Liu YH,et al.Decreased expression of DAB2IP in pancreatic cancer with wild-type KRAS[J].Hepatobiliary Pancreat Dis Int,2013,12(2):204-209.

[12]Homayouni R,Magdaleno S,Keshvara L,et al.Interaction of Disabled-1 and the GTPase activating protein Dab2IP in mouse brain[J].Brain Res Mol Brain Res,20013, 115(2):121-129.

[13]Duggan D,Zheng SL,Knowlton M,et al.Two genomewide association studies of aggressive prostate cancer implicate putative prostate tumor suppressor gene DAB2IP[J].J Natl Cancer Inst,2007,99(24):1836-1844.

[14]Xie D,Gore C,Zhou J,et al.DAB2IP coordinates both PI3K-Akt and ASK1 pathways for cell survival and apoptosis[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2009,106(47): 19878-19883.

[15]Chen H,Toyooka S,Gazdar AF,et al.Epigenetic regulation of a novel tumor suppressor gene(hDAB2IP)in prostate cancer cell lines[J].J Biol Chem,2003,278(5): 3121-3130.

[16]Yano M,Toyooka S,Tsukuda K,et al.Aberrant promoter methylation of human DAB2 interactive protein(hDAB2IP) gene in lung cancers[J].Int J Cancer,2005,113(1):59-66.

Construction of lentiviral vector of DAB2IP gene and its expression in prostate carcinoma PC3 cells

HUA Xing1,PAN Wen-hai2
(1.Department of Pathology,Forth Affiliated Hospital,Jinan University,Guangzhou Red Cross Hospital,Guangzhou 510515,China;2.Department of Urinary Surgery,Forth Affiliated Hospital, Jinan University,Guangzhou Red Cross Hospital,Guangzhou 510515,China)

ObjectiveTo construct recombinant lentiviral vector pSin-EF2-Puro-DAB2IP transfect prostate carcinoma PC3 cells,and to observe its transfection rate and expression level in PC3 cells.MethodsThe cDNA sequences specifically targeting the DAB2IP gene were designed and cloned into lentiviral vector PC3-pSin usingDNA recombinant technique.Using PC3-pSin-EF2 as control,the 293T cells were transfected by Lipofectamine reagent for lentiviral particles packaged,and viral titer was determined.The DAB2IP mRNA and protein expression levels were examined by RT-PCR and Western blotting methods.ResultsThe PCR and sequencing analysis results confirmed that the DAB2IP gene sequence was consistent with the sequence in GeneBank.The number of DAB2IP gene copy in PC3-pSin-EF2-DAB2IP cells and its control PC3-pSin-EF2 cells were 0.001±0.000 and 0.158±0.013,respectively.Compared with control cells,the overexpression of m RNA in PC3-pSin-EF2-DAB2IP cells upregulated(179.370±15.891)times,the difference was statistically significant(P＜0.001). Compared with internal reference and control cells,the expression levels of DAB2IP protein in PC3-pSin-EF2-DAB2IP cells upregulated(2.431±0.892)times and(2.415±0.961)times respectively,the differences were statistically significant(P＜0.001).ConclusionThe lentiviral vector of the DAB2IP gene pSin-EF2-Puro-DAB2IP is successfully constructed,and its targeted gene is stably expressed in the targeted cells,which provides a basis for the further functional study of DAB2IP.

DAB2IP;lentiviral vector;prostate neoplasms

R737.25

A

2014-01-24

国家自然科学基金面上项目资助课题(81272849);广东省科技厅科技计划项目资助课题(2011B061200021)

华 兴(1975－),男,安徽省安庆市人,副主任医师,医学博士,主要从事泌尿男科基础和临床病理研究。

潘文海(Tel:020-34403830,E-mail:pwh189＠189.cn)

时间: 2014-08-27 14:38

网络出版地址: http://www.cnki.net/kcms/detail/22.1342.R.20140827.1438.001.html

1671-587Ⅹ(2014)05-0938-05

10.13481/j.1671-587x.20140506