大电导钙激活钾通道β1亚基与子痫前期的相关性研究

王书宏　徐琳　颜丽丽

【摘要】 目的：探讨胎盘组织和子宫平滑肌组织中大电导钙激活钾通道β1亚基（KCNM β1）的表达，及其与子痫前期发病的关系。方法：轻、重度子痫前期组（研究组）和正常孕妇组（对照组）孕妇的胎盘组织及子宫平滑肌组织中KCNM βl mRNA的表达通过荧光定量PCR技术检测。采用ELISA法检测三组孕妇血清KCNM βl浓度变化水平。结果：各研究组中孕妇血清的KCNM βl水平、胎盘组织及子宫平滑肌中KCNM βl mRNA表达水平均明显低于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）；而轻、重度子痫前期组比较差异均无统计学意义（P>0.05）。结论：孕妇血清中KCNM βl表达降低，胎盘组织和子宫平滑肌中KCNM βl mRNA的表达降低与子痫前期的发病密切相关，可能参与了子痫前期的病理生理过程。

【关键词】 子痫前期； 大电导钙激活钾通道β1亚基； 胎盘； 子宫平滑肌； 血清

【Abstract】 Objective： To investigate the relationship between the pathogenesis of preeclampsia（PE） and the mRNA and protein expression of KCNM β1 subunit in placenta and uterine smooth muscle tissue.Method： The pregnant placenta tissue and KCNM βl mRNA expression in uterine smooth muscle tissue of the mild and severe preeclampsia group （the study group） and the normal pregnant women （the control group） were detected by fluorescent quantitative PCR technique. The serum KCNM βl concentration level changes of three groups pregnant women were detected by ELISA method. Result： The pregnant women serum level of KCNM βl， placenta and uterus smooth muscle in KCNM βl mRNA expression levels of the research group were significantly lower than the control group， the difference had statistical significance （P<0.05）； there were no significant difference between the mild and severe preeclampsia group（P>0.05）. Conclusion： KCNM βl expression in serum of pregnant women is reduced， the placenta tissue and smooth muscle of the uterus KCNM βl mRNA expression in lower closely associated with the onset of preeclampsia， may be involved in the pathophysiological process of preeclampsia.

【Key words】 Preeclampsia； Large conductance Ca2+-activated K+-channel β1 subunit； Placenta； Uerine smooth muscle tissue； Blood serum

子痫前期是妊娠期高血压疾病最常见的类型，其发病率为5%～10%，其导致孕产妇的死亡总数仅次于产后出血和羊水栓塞。目前妊娠期高血压疾病至今病因不明，有研究将高血压病视为一种细胞膜疾病，高血压的产生是由于大电导钙激活钾通道（high-conductance calcium activated potassium channels，BKca）的缺陷，不能反馈相应代偿作用，而导致动脉平滑肌膜电位极化障碍，使血管紧张性增高，促进高血压的产生[1]。大电导钙激活钾通道β1亚基（KCNM β1）与子痫前期的相关性目前国内外均无研究，本研究通过孕妇血清中KCNM βl的表达及胎盘组织和子宫平滑肌中KCNM βl mRNA的表达，探讨KCNM βl与子痫前期发病的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2012年2月-2013年2月在本院剖宫产分娩的轻、重度子痫前期孕妇为研究组，轻、重度组各19例；选取同期正常妊娠孕妇20例为对照组。子痫前期的诊断标准参照丰有吉主编的第7版8年制《妇产科学》[2]。研究组患者均符合以下条件：（1）产妇年龄在26～34岁之间；（2）无高血压病史及家族史。对照组患者均符合以下条件：（1）产妇年龄在24～34岁之间；（2）无高血压疾病家族史；（3）妊娠期间血压监测记录一直保持在正常范围，即BP<140/90 mm Hg。本次妊娠均为单胎，研究组的孕妇既往无高血压病及慢性肾炎病史。两组孕妇的年龄、分娩孕周比较差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。所有孕妇在研究前均签署知情同意书，并经医院伦理委员会批准实施。

1.2 试剂和实验方法

1.2.1 主要试剂及仪器 Total RNA提取试剂（Trizol）和荧光定量PCR试剂盒均购自日本Takara公司，DNA Maker购自北京百泰克生物有限公司，GelRed荧光核酸染色试剂（Unired）购自美国 Biotium公司。KCNM βl引物由上海生工生物工程有限公司合成，酶联免疫吸附试验（ELISA试剂盒）购自青岛浩赛科技有限公司，所有标本同批测定，批内变异<6%。上海瑞仪公司PCR扩增仪。德国Eppendorf公司常温微量离心机。

1.2.2 标本采集 术前抽取所有孕妇空腹静脉血并分离血清保存，以检测血清中KCNMβl的浓度。剖宫产术中取胎盘组织约2 cm×2 cm×2 cm大小，再取一块子宫平滑肌各约1 cm×1 cm×1 cm大小，分别置于EP管中，冷冻保存以提取RNA。

1.2.3 实验方法 （1）血清KCNM βl测定：采用ELISIA法，于回归方程上计算所测样本的OD值所对应的样品浓度。所有标本同批测定，批内变异<6%。（2）子宫平滑肌组织和胎盘组织中的KCNMβl mRNA的提取及测定：所取到的组织通过荧光定量PCR法测定总RNA，严格按照试剂盒操作进行检测。取波长260 nm及280 nm的紫外分光光度计检测总RNA样品的纯度及浓度，并稀释后经l.2%琼脂糖凝胶电泳检测，紫外线下得到完整的5S、18S及28S三条RNA条带。（3）荧光定量PCR：PCR引物参考国内外的相关文献，设计KCNM βl的PCR引物序列，并与Gene Bank中的基因谱一一核对无误。PCR引物序列及长度见表1。引物稀释至浓度为20 ?mol/L，在Microtube管中配制反转录反应液（详见表2），并在PCR仪上进行反转录反应。按表1.4配制PCR反应液，进行荧光定量PCR反应。荧光定量PCR反应体系：SYBR Primix Ex TaqTMⅡ 10 μL、上下游引物各0.8 μL，超纯水6.4 μL，cDNA产物2.0 μL；PCR扩增条件为：（1）预变性95 ℃、30 s，1个循环；（2）95 ℃、5 s，60 ℃、20 s，40个循环；（3）95 ℃、0 s，65 ℃、15 s，95 ℃、0 s。荧光定量PCR检测得到各基因引物的标准曲线和扩增效率。电泳结果用紫外线凝胶自动成像分析仪进行扫描、分析扩增产物的长度和序列，以及扩增的特异性。荧光定量PCR检测得到各基因引物的标准曲线和扩增效率。

1.3 统计学处理 用SPSS 17.0软件进行数据统计分析，计量资料以（x±s）表示，比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。各组织中KCNM βl表达水平采用直线相关分析法。

2 结果

2.1 三组孕妇血清中KCNM βl水平的比较 轻度子痫前期组血清KCNMβl为（85.02±55.67）pg/mL，重度子痫前期组为（72.32±49.92）pg/mL，对照组为（150.13±76.17）pg/mL。轻、重度子痫前期组血清血清KCNM βl的表达结果与对照组比较差异均有统计学意义（t=1.51，P<0.05；t=0.43，P<0.05），前两组间差异也有统计学意义（P<0.05）。

2.2 三组孕妇胎盘组织中KCNM βl mRNA表达水平的比较 轻、重度子痫前期组胎盘组织中KCNM βl mRNA表达水平均低于对照组，差异有统计学意义（t=3.69、17.11，P<0.05）；但轻、重度子痫前期组间比较差异无统计学意义（t=2.73，P>0.05），见表3。

2.3 三组孕妇子宫平滑肌组织中KCNM βl mRNA表达水平的比较 轻、重度子痫前期组子宫平滑肌中KCNM βl mRNA表达水平均低于对照组，差异均有统计学意义（t=4.75、t=7.40，P<0.05）；但轻、重度子痫前期组间比较差异无统计学意义（t=2.70，P>0.05），见表3。

2.4 同组孕妇胎盘与子宫平滑肌组织中KCNM βl表达水平的比较 子宫平滑肌及胎盘组织中血清KCNM βl表达水平采用直线相关分析法，得出r=0.2。提示各组组织中血清KCNM βl表达水平不相关。

3 讨论

子痫前期是以妊娠期高血压和蛋白尿为主要临床特征，其基本病理生理变化是全身小动脉痉挛，但其发病机制尚未完全明确。血管平滑肌细胞膜上有很多密度不同的钾通道，其中，钙激活的钾通道（KCa）广泛分布于血管平滑肌细胞，大电导钙激活钾通道（BKca）又称为Maxi-K channel，是其中的一个亚类。BKCa通道由结构亚单位α和调节亚单位β组成，α-亚单位跨膜区的片段中包含感受细胞内Ca2+变化的胞浆域（the cytosolic domain，CTD），而CTD其中之一的K+电导调节元件（regulator of K conductance，RCK）即RCK1，因其具有高亲和力的Ca2+传感器，与Ca2+结合后CTD的构型重新排列[3]，是人体BKCa通道Ca2+依赖性激活的基本阶段。β-亚单位特别是β1-亚单位因可调控通道，而增强α-亚单位的功能。BKCa通道功能可因不同组织中β1和α亚单位表达量的不同而表现出组织的特质性。相关研究表明，大脑中的β1和α亚单位的比例高于身体其他部位，同时脑血管BKCa通道具有更高的通道开放概率和Ca2+敏感性[4]。而当β1-亚单位下调时，BKCa通道的开放概率降低，同时对Ca2+的敏感性也降低，动脉舒张功能受限，成为高血压等疾病的病理基础[5]。

平滑肌BKCa通道多表达β1亚基，提高了平滑肌组织的BKCa对Ca2+的敏感性，是构成细胞复极化电流的重要钾离子通道之一。在正常机体的生理状态下，BKca可因血压升高而激活[6]，负反馈调节平滑肌收缩，而BKca的超极化可引起血管平滑肌的舒张，微血管的这种舒缩使微循环血流不会随血管内压变化而有太大的改变。

有报道在KCNM β1基因敲除的小鼠中，其平均动脉压远比正常小鼠和α亚基因敲除的小鼠高，而且高血压表现为进行性。提示β1亚单位在调节血压占主导作用，缺失易产生中度高血压[7]。国内贺同强等[8]报道，实验组妊娠期高血压病疾病孕妇的胎盘血管平滑肌细胞的钾电流密度比正常孕妇组减小，提示胎盘细胞膜上的钾通道的改变与妊高症的产生具有密不可分的关联。关于子痫前期孕妇血清及胎盘组织中KCNM βl水平变化与高血压的相关性尚未明确，本研究发现子痫前期孕妇血清及胎盘组织中KCNM βl表达均明显低于正常孕妇，推测血清中KCNM βl可能通过上述机制参与子痫前期高血压的发生发展。胎盘组织可能通过胎盘血管参与这一机制从而参与子痫前期高血压的发生发展。

在平滑肌细胞中，如血管平滑肌、子宫平滑肌等，BKCa通道通过参与膜电位和肌紧张等生理过程而调节平滑肌运动[9-10]。而子宫平滑肌细胞的BKCa通道结构中仅含β1亚基，蛋白激酶G（PKG）的磷酸化部位位于β1亚单位上，在妊娠期BKCa通道的β1亚基随着分布密度、电压激活及钙的敏感性的改变来调节平滑肌的收缩。当β1亚单位减少，PKG磷酸化减少，而抑制BKCa通道活性，促进平滑肌收缩。刘芬等[11]研究结果表明，敲除β1亚单位进行基因，不但BKCa通道的钙敏感性降低，而且子宫动脉的平滑肌张力增加，血压随之升高。同时在孕期由于雌二醇（E2）浓度的不断增加，子宫平滑肌组织中的β1亚单位的表达降低[12]。因此可以推测，子宫平滑肌中KCNM βl水平的降低，可能导致孕妇高血压的产生。本研究显示子痫前期孕妇子宫平滑肌中KCNM βl表达明显低于正常孕妇，推测子宫平滑肌中KCNM βl水平降低是通过以上机制参与了子痫前期高血压的发生发展。

近几年来随着对BKCa通道的深入研究，发现其与多种疾病的发生发展有着密切的相关性。以后的医学实验将更进一步的研究BKCa通道结构及功能，以便对妊娠期高血压疾病及先兆子痫的预防提供有利证据，并可望为治疗先兆子痫提供新的理论依据。

参考文献

[1] Paterno R，Heistad D D，Faraci F M.Functional activity of Ca2+-dependent K+ channels is increased in basilar artery during chronic hypertension[J].Am J Physiol，1997，272（3Pt 2）：H1287-1291.

[2]丰有吉，沈铿.妇产科学[M].北京：人民卫生出版社，2008：92-94.

[3] Yusifov T，Javaherian A D，Pantazis A，et al.The RCK1 domain of the human BKCa channel transduces Ca2+ binding into structural rearrangements[J].J Gen Physiol，2010，136（12）：189-202.

[4] Yang Y，Sohma Y，Nourian Z，et al.Mechanisms underlying regional differences in the Ca2+ sensitivity of BKCa current in arteriolar smooth muscle[J].J Physiol，2013，591（12）：1277-1293.

[5] Yang Y，Li P Y，Cheng J，et al.Function of BKCa channels is reduced in human vascular smooth muscle cells from han Chinese patients with hypertension[J].Hypertension，2013，61（23）：519-525.

[6]刘书宏，曾晓荣，杨艳，等.大电导钙激活钾通道及其与高血压的关系[J].医学综述，2006，12（15）：45-46.

[7] Pluznick J L，Wei P，Carmines P K，et al.Renal fluid and electrolyte handling in BKCa-beta1-/-mice[J].Am J Physiol Renal Physiol，2003，284（6）：F1274-1279.

[8]贺同强，苟文丽，李雪.妊娠期高血压疾病钾通道功能的改变[J].中国妇幼健康研究，2007，18（4）：279-281.

[9] Herrera G M，Heppner T J，Nelson M T.Regulation of urinary bladder smooth muscle contractions by ryanodine receptors and BK and Skca channels[J].Am J Physiol，2000，279（1）：60-68.

[10] Stankevicius E，Lopez-Valverde V，Rivera K，et a1.Combination of Ca2+-activated K+ channel blockers inhibits acetylcholine-evoked nitric oxide release in rat superior Mesenteric artery[J].Br J Pharmac，2006，149（5）：560-572.

[11]刘芬，丁依玲.子宫肌层中大电导钙激活钾通道的表达与分娩发动的关系[D].中南大学硕士学位论文，2008：1-2.

[12] Nagar D，Uu X T，Rosenfeld C R.Estrogen regulatesβl-subunit expression in Ca2+-activated K+channelsin arteries from reproductive tissues[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2005，289（4）：1417-1427.

（收稿日期：2014-03-05） （本文编辑：蔡元元）

在平滑肌细胞中，如血管平滑肌、子宫平滑肌等，BKCa通道通过参与膜电位和肌紧张等生理过程而调节平滑肌运动[9-10]。而子宫平滑肌细胞的BKCa通道结构中仅含β1亚基，蛋白激酶G（PKG）的磷酸化部位位于β1亚单位上，在妊娠期BKCa通道的β1亚基随着分布密度、电压激活及钙的敏感性的改变来调节平滑肌的收缩。当β1亚单位减少，PKG磷酸化减少，而抑制BKCa通道活性，促进平滑肌收缩。刘芬等[11]研究结果表明，敲除β1亚单位进行基因，不但BKCa通道的钙敏感性降低，而且子宫动脉的平滑肌张力增加，血压随之升高。同时在孕期由于雌二醇（E2）浓度的不断增加，子宫平滑肌组织中的β1亚单位的表达降低[12]。因此可以推测，子宫平滑肌中KCNM βl水平的降低，可能导致孕妇高血压的产生。本研究显示子痫前期孕妇子宫平滑肌中KCNM βl表达明显低于正常孕妇，推测子宫平滑肌中KCNM βl水平降低是通过以上机制参与了子痫前期高血压的发生发展。

近几年来随着对BKCa通道的深入研究，发现其与多种疾病的发生发展有着密切的相关性。以后的医学实验将更进一步的研究BKCa通道结构及功能，以便对妊娠期高血压疾病及先兆子痫的预防提供有利证据，并可望为治疗先兆子痫提供新的理论依据。

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[11]刘芬，丁依玲.子宫肌层中大电导钙激活钾通道的表达与分娩发动的关系[D].中南大学硕士学位论文，2008：1-2.

[12] Nagar D，Uu X T，Rosenfeld C R.Estrogen regulatesβl-subunit expression in Ca2+-activated K+channelsin arteries from reproductive tissues[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2005，289（4）：1417-1427.

（收稿日期：2014-03-05） （本文编辑：蔡元元）

在平滑肌细胞中，如血管平滑肌、子宫平滑肌等，BKCa通道通过参与膜电位和肌紧张等生理过程而调节平滑肌运动[9-10]。而子宫平滑肌细胞的BKCa通道结构中仅含β1亚基，蛋白激酶G（PKG）的磷酸化部位位于β1亚单位上，在妊娠期BKCa通道的β1亚基随着分布密度、电压激活及钙的敏感性的改变来调节平滑肌的收缩。当β1亚单位减少，PKG磷酸化减少，而抑制BKCa通道活性，促进平滑肌收缩。刘芬等[11]研究结果表明，敲除β1亚单位进行基因，不但BKCa通道的钙敏感性降低，而且子宫动脉的平滑肌张力增加，血压随之升高。同时在孕期由于雌二醇（E2）浓度的不断增加，子宫平滑肌组织中的β1亚单位的表达降低[12]。因此可以推测，子宫平滑肌中KCNM βl水平的降低，可能导致孕妇高血压的产生。本研究显示子痫前期孕妇子宫平滑肌中KCNM βl表达明显低于正常孕妇，推测子宫平滑肌中KCNM βl水平降低是通过以上机制参与了子痫前期高血压的发生发展。

近几年来随着对BKCa通道的深入研究，发现其与多种疾病的发生发展有着密切的相关性。以后的医学实验将更进一步的研究BKCa通道结构及功能，以便对妊娠期高血压疾病及先兆子痫的预防提供有利证据，并可望为治疗先兆子痫提供新的理论依据。

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[7] Pluznick J L，Wei P，Carmines P K，et al.Renal fluid and electrolyte handling in BKCa-beta1-/-mice[J].Am J Physiol Renal Physiol，2003，284（6）：F1274-1279.

[8]贺同强，苟文丽，李雪.妊娠期高血压疾病钾通道功能的改变[J].中国妇幼健康研究，2007，18（4）：279-281.

[9] Herrera G M，Heppner T J，Nelson M T.Regulation of urinary bladder smooth muscle contractions by ryanodine receptors and BK and Skca channels[J].Am J Physiol，2000，279（1）：60-68.

[10] Stankevicius E，Lopez-Valverde V，Rivera K，et a1.Combination of Ca2+-activated K+ channel blockers inhibits acetylcholine-evoked nitric oxide release in rat superior Mesenteric artery[J].Br J Pharmac，2006，149（5）：560-572.

[11]刘芬，丁依玲.子宫肌层中大电导钙激活钾通道的表达与分娩发动的关系[D].中南大学硕士学位论文，2008：1-2.

[12] Nagar D，Uu X T，Rosenfeld C R.Estrogen regulatesβl-subunit expression in Ca2+-activated K+channelsin arteries from reproductive tissues[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2005，289（4）：1417-1427.

（收稿日期：2014-03-05） （本文编辑：蔡元元）