人卵巢颗粒细胞FoxO基因和卵泡刺激素受体基因的表达及相关性研究

梁 莹，米梅艳，李淑贤，周 莉，吴晓茜，雷灵梅

（1.河北省石家庄市第四医院生殖中心，河北 石家庄 050011；2.河北省石家庄市第四医院妇科，河北 石家庄050011；3.河北省石家庄市第四医院检验科，河北 石家庄050011）

人卵巢颗粒细胞FoxO基因和卵泡刺激素受体基因的表达及相关性研究

梁 莹1，米梅艳2*，李淑贤2，周 莉1，吴晓茜1，雷灵梅3

（1.河北省石家庄市第四医院生殖中心，河北 石家庄 050011；2.河北省石家庄市第四医院妇科，河北 石家庄050011；3.河北省石家庄市第四医院检验科，河北 石家庄050011）

目的 研究人卵巢颗粒细胞叉头框（forkhead box，Fox）基因和卵泡刺激素受体（follicle stimulating hormone receptor，FSHR）的表达及相关性。方法 接受体外受精－胚胎移植（in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET）不孕症患者126例，按照妊娠结果分为妊娠组63例，未妊娠组63例。回顾性分析取卵日成熟卵泡壁颗粒细胞FoxO1、FoxO3a和 FSHR mRNA的表达，并对 FoxO1、FoxO3a、FSHR之间及与血清促黄体生成素（luteotropic hormone，LH）、雌二醇（estradiol，E2）、孕酮（progesterone，P）进行相关性分析。结果 妊娠组血清 E2水平高于未妊娠组（P＜0.01）；妊娠组优质胚胎数多于未妊娠组（P＜0.01）；2组LH、P、获卵数差异无统计学意义（P＞0.05）。妊娠组FoxO1 mRNA表达高于未妊娠组（P＜0.01）；2组FoxO3a及FSHR mRNA差异无统计学意义（P＞0.05）。FoxO1和FoxO3a与FSHR的相关性系数分别为0.881、0.999（P＜0.01i）。结论 FoxO1和FoxO3a参与卵母细胞质量的调节，其功能与FSHR有密切关系。

卵泡刺激素，人；卵丘细胞；卵母细胞

人卵母细胞位于卵泡内，由颗粒细胞包围，与颗粒细胞之间有相互的对话和作用。卵母细胞能够诱导颗粒细胞增殖与分化，而颗粒细胞对卵母细胞有营养支持的作用。因此，颗粒细胞增殖、分化与凋亡能够影响卵母细胞质量。有文献［1］报道，接受体外受精－胚胎移植（in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET）治疗患者的壁层颗粒细胞和卵丘细胞凋亡率低与其卵母细胞的发育和受精能力呈正相关。Forkhead（Fox）转录因子在 2000年发布统一命名，因它们在生物体内的重要作用，成为科学研究的热点［2－3］。FoxO是通过转录和信号转导途径在动物的组织代谢、发育以及细胞的周期调控等方面有重要作用［2，4－5］，它们是胰岛素／胰岛素样生长因子（insulin／insulin-like growth factor 1，INS／IGF-1）信号通路中关键因子之一。研究［6－7］表明，FoxO1、FoxO3a在细胞的增殖和凋亡过程中起着重要的作用。因而本研究选取FoxO1、FoxO3a以及卵泡刺激素受体（follicle stimulating hormone receptor，FSHR）基因，研究其在颗粒细胞上的表达及它们之间的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料：选择2010年9月—2011年7月在河北省石家庄市妇产医院生殖医学中心接受IVFET治疗的不孕症患者126例，诊断标准参考《妇产科学》第7版［8］。按照妊娠结局分为妊娠组和未妊娠组。其中妊娠组 63例，年龄 23～39岁，平均（29.36±4.03）岁；未妊娠组 63例，年龄24～39岁，平均（29.40±3.19）岁。2组一般资料比较差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。该研究经医院伦理委员会批准。

1.2 纳入及排除标准：纳入标准符合西医诊断标准。①年龄＜40岁；②基础卵泡刺激素＜10U／L；③签署知情同意书。排除标准为子宫内膜异位症；子宫不具备妊娠功能或严重躯体疾病不能承受妊娠；泌尿生殖系统感染；性传播疾病；患有严重的精神疾患；有吸毒等严重不良嗜好；接触致畸量的射线和毒物并处于作用期。

1.3 治疗方法：所有患者采用常规长方案促排卵治疗，月经的第21天或黄体中期开始皮下注射醋酸曲普瑞林（Triptorelin Acetate，0.1mg／支，法国博福－益普生，D22863）0.1mg／d，至少 14d。达到降调节标准后，即子宫内膜≤5mm，血清雌二醇（estradiol，E2）＜50ng／L后，每日注射重组人促卵泡激素（Gonal-F，果 那 芬，75U／支，默 克 雪 兰 诺，AU002290）250～300U／d，观察血清促黄体生成素（luteotropic hormone， LH ）、 E2、 孕 酮（progesterone，P）及 B超监测卵泡发育情况，当60%卵泡的直径≥18mm时停药，给予重组绒促性素250g（艾泽，250g／支，默克雪兰诺，DA009256）诱导卵泡成熟，36～38h经阴道超声引导下穿刺取卵。1.4 观察指标及方法：阴道B超指引下行穿刺取卵术并留取优势卵泡的卵泡液。卵泡液1 500r／min离心10min，在沉淀物中加入PBS至5mL制成混悬液。取 15mL离心管并加入人淋巴细胞分离液5mL。将混悬液缓慢加入淋巴细胞分离液面上，1 200r／min离心20min，吸取在两液面之间的细胞层加PBS 3 000r／min离心 5min，下层即为壁颗粒细胞。标本加入2mL Trizol液（Invitrogen公司）完全裂解后置于－80℃冻存（用于实时荧光定量PCR）。

采用化学发光微粒子免疫测定法测定性激素，由美国ARCHITECT公司提供LH、E2、P试剂盒。按试剂说明书同批专人操作。

1.5 卵泡壁颗粒细胞FoxO1、FoxO3a及FSHR mRNA表达：实时荧光定量PCR法测定。两组取2μg总RNA反转录，分别以人甘油醛-3-磷酸脱氢酶 （glyteraldehyde-3-phosphate dehydrvgenase，GAPDH）、FoxO1、FoxO3a及FSHR的特异性引物进行PCR反应。引物序列利用GenBank数据库中提供的基因序列，经GenBank BLAST进行同源性检测，用DNAman version 6软件设计，上海生工生物工程有限公司合成。引物序列如下。GAPDH-上游，5′-TGAACGGGAAGCTCA-CTGG-3，GAPDH-下游，5′-GCTTCACCACCTTCTTGA TGTC-3′；FoxO1-上游，5′-TGAGGGTTAGTGAGCAGGTTAC-3′，FoxO1-下游，5′-AGGGAGTTGGTGAAAGACATC-3′；FoxO3a-上游，5′-TGCTCACTTCGGACTCACTTAG-3′， FoxO3a-下 游， 5′-GCAAAGGACATCATCGGA-3′；FSHR-上游，5′-ACATCTACCTCACAGTGCGG-3′，FSHR-下游，5′-AAAGAAAGAAATGGGTGCC-3′。ABI 7300型实时荧光定量 PCR仪进行扩增，95℃预变性 5 min，然后 95℃ 15s、58℃ 20s、72℃ 27s反应40个循环。FoxO1、FoxO3a及FSHR mRNA表达量以2－△△CT来表示，其值为以FoxO1、FoxO3a及FSHR的mRNA表达量与GAPDH表达量的比值，再将对照组某某的量设为1，其余样本的数值与其相除，得到相对定量值。每个目的基因测定重复3次。

1.6 统计学方法：应用SPSS13.0统计软件进行数据处理。计量资料以表示，组间比较采用t检验；计数资料以百分率表示，组间比较采用χ2检验；相关性采用直线相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 2组血清LH、E2、P水平及获卵数、优质胚胎率比较：妊娠组血清E2水平高于未妊娠组，差异有统计学意义（P＜0.01）。妊娠组优质胚胎数多于未妊娠组，差异有统计学意义（P＜0.01）。2组LH、P、获卵数指标差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 2组取卵日血清LH、E2、P水平及获卵数和优质胚胎率比较Table 1 Comparison of serum LH，E2，P level，number of eggs，fertilization rate and high embryo quality between two groups（n＝63，）

表1 2组取卵日血清LH、E2、P水平及获卵数和优质胚胎率比较Table 1 Comparison of serum LH，E2，P level，number of eggs，fertilization rate and high embryo quality between two groups（n＝63，）

LH：luteotropic hormone；E2：estradiol；P：progesterone

Groups LH（U／L） E2（ng／L） P（ng／L） Number of eggs High embryo quality（%，n）Pregnancy 0.891±0.632 3 960.383±232.401 7.92±0.91 13.912±5.722 50.417（363／720）Non-pregnancy 1.162±0.983 3 120.814±306.023 7.83±0.79 12.498±4.213 29.292（203／693）t／χ21.839 17.340 0.593 1.579 65.622 P ＞0.05 ＜0.01 ＞0.05 ＞0.05 ＜0.01

2.2 2组壁颗粒细胞FoxO1、FoxO3a及FSHR mRNA表达比较：126例患者壁颗粒细胞上均有FoxO1、FoxO3a及FSHR mRNA表达。妊娠组FoxO1 mRNA表达高于未妊娠组，差异有统计学意义（P＜0.01）。2组FoxO3a及FSHR mRNA差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 2组壁颗粒细胞FoxO1和 FoxO3a及FSHR mRNA表达比较Table 2 Comparison of FoxO1，FoxO3a and FSHR mRNA expression between two groups（n＝63，）

表2 2组壁颗粒细胞FoxO1和 FoxO3a及FSHR mRNA表达比较Table 2 Comparison of FoxO1，FoxO3a and FSHR mRNA expression between two groups（n＝63，）

Groups FoxO1 mRNA FoxO3a mRNA FSHR mRNA Pregnancy 0.786±0.152 0.923±0.162 0.743±0.238 Non-pregnancy 0.383±0.102 0.842±0.341 0.691±0.372 t 17.474 1.703 0.346 P ＜0.01 ＞0.05 ＞0.05

2.3 相关性分析：126例患者 FoxO1、FoxO3a及FSHR表达相关性分析显示，FoxO1与FoxO3a相关（r＝0.885，P＜0.01）；FoxO1、FoxO3a与FSHR相关（r＝0.881、0.999，P＜0.01）。

FoxO1、FoxO3a及FSHR表达与血清 LH、E、P水平相关性分析显示，FoxO1与血清LH、E、 P水平不相关（r＝0.007、0.288、0.024，P＞0.05），FoxO3a与血清LH、E2、P水平不相关（r＝1.000、－0.010、0.222，P＞0.05）；FSHR与血清LH、E2、P水平不相关（r＝0.219、0.177、0.260，P＞0.05）。

3 讨 论

FSHR 与卵泡刺激素 （follicle stimulating hormone，FSH）结合并激活环磷酸腺苷／蛋白激酶A下游通路，促进颗粒细胞分化增殖、卵泡发育及成熟［9－10］。FSHR与卵巢反应性密切相关。FSH在这一过程中发挥了重要作用。采用合适的促排卵方案获得数量适中的优质卵子及胚胎是 IVF治疗成功的关键。FSH发挥作用要受到FSHR的调节，FSHR属G蛋白偶联受体家族成员，特异性地存在于卵巢颗粒细胞中。FSH在生殖方面的重要作用使得FSHR成为临床上调控生育的一个突出目标，颗粒细胞上FSHR表达情况也因此成为卵泡生长发育的关键。本研究中基因表达，2组差异无统计学意义，提示妊娠组优胚数明显高于未妊娠组，提示妊娠组卵母细胞质量明显优于未妊娠组，但是FSHR不直接决定卵母细胞质量。而本研究中对FoxO1、FoxO3a与FSHR表达进行相关性分析，发现FoxO1、FoxO3a与FSHR都具有强相关性。提示FoxO信号通路与FSHR的表达功能上密切相关。有研究［11］显示，FSH通过活化卵巢颗粒细胞磷脂酰肌醇3激酶－丝氨酸激酶通路，调节FoxO1基因转录和蛋白的磷酸化，从而对颗粒细胞的增生、分化进行调控。而本研究结果提示，FSHR水平也参与了对FoxO1和FoxO3a基因表达的调节。推测在FSHR及其后的环节FoxO信号通路通过颗粒细胞对卵子的发育、卵巢反应性有重要的调节作用，这一推论还需要更多的实验验证。

既往的研究［7］显示 FoxO1和 FoxO3a是细胞增殖的负调控者，它们的高表达诱导细胞增殖的停止。FoxO1和FoxO3a还是细胞凋亡的诱导者，高表达可以诱导细胞的凋亡［8］。研究［12］显示，FoxO3a参与小鼠原始卵泡的凋亡调控。人卵巢颗粒上有 FoxO家族基因的表达，包括 FoxO1、FoxO3a、FoxO4。次级卵泡的体外培养还发现，Wnt／β-catenin信号通路通过FoxO3a基因实现对卵泡发育的负调控［13］。基因敲除颗粒细胞FoxO1／3的模型显示，垂体的FSH受到了调节，因而推测FoxO1和FoxO3a在颗粒细胞上的功能与FSH密切相关［14］。而氧化应激信号可以通过上调颗粒细胞FoxO1的表达诱导凋亡［15］。研究［16］还显示对FSH信号刺激颗粒的细胞增殖需要解除FoxO1信号的抑制。上述研究均显示颗粒细胞上FoxO1和FoxO3a抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡，并且与FSH对颗粒细胞的调控密切相关。本研究结果显示FoxO1和FoxO3a与颗粒细胞上FSHR密切相关，从受体的角度提示了FoxO1和FoxO3a与FSH在生殖方面的重要作用的关联。但是FoxO1在妊娠组的高表达，却与既往的研究结果不一致。推测以往的研究都在原始和卵泡发育早期，而本研究选取的是晚卵泡期的颗粒细胞，生理情况下这一时期的小FSH峰及高的LH峰共同完成对排卵功能以及卵母细胞成熟的的调节，FoxO1的高表达可能与负调节FSH信号有关，其有关的机制还需要进一步的实验研究。

［1］NAKAHARA K，SAITO H，SAITO T，et al.The incidence of apoptotic bodies in membrane granulosa can predict prognosis of ova from patients participating in in vitro fertilization programs［J］.Fertil Steril，1997，68（2）：312－317.

［2］KAESTNER KH，KNOCHEL W，MARTINEZ DE.Unified nomenclature for the winged helix／forkhead transcription factors［J］.Genes Dev，2000，14（2）：142－146.

［3］CZECH MP.Insulin′s expanding control of forkheads［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2003，100（20）：11198－11200.

［4］ARDEN KC，BIGGS WH.Regulation of the FoxO family of transcription factors by phosphatidylinositol-3 kinaseactivated signaling［J］.Arch Biochem Biophys，2002，403（2）：292－298.

［5］PUIG O，MARR MT，RUHF ML，et al.Control of cell number by drosophila FOXO：downstream and feedback regulation of the insulin receptor pathway［J］.Genes Dev，2003，17（16）：2006－2020.

［6］BRUNET A，SWEENEY LB，STURGILL JF，et al.Stressdepende regulation of FOXO transcription factors by the SIRT deacetylase［J］.Science，2004，303（5666）：2011－2015.

［7］GIANNAKOU ME，PARTRIDGE L.The interaction between FOXOand SIRT1：tipping the balance towards survival［J］.Trends Cell Biol，2004，14（8）：408－412.

［8］乐杰.妇产科学［M］.7版.北京：人民卫生出版社，2008：351.

［9］YAN Y，GONG Z，ZHANG L，et al.Association of folliclestimulating hormone receptor polymorphisms with ovarian response in Chinese women：a prospective clinical study［J］.PLoS One，2013，8（10）：e78138.

［10］HUNZICKER-DUNNM，MAIZELSET.FSHsignaling pathways in immature granulosa cells that regulate target gene expression：branching out from protein kinase A［J］.Cell Signal，2006，18（9）：1351－1359.

［11］THAPAR R，DENMON AP.Signaling pathways that control mRNA turnover［J］.Cell Signal，2013，25（8）：1699－1710.

［12］罗丽莉，黄菊，陏旭霞，等.FOXO3a转录因子参与调控新生大鼠卵母细胞凋亡的实验研究［J］.生殖与避孕，2007，27（5）：314－319.

［13］LI L，JISY，YANG JL，etal.Wnt／β-cateninsignaling regulates follicular development by modulating the expression of Foxo3a signaling components［J］.Mol Cell Endocrinol，2013，382（2）：915－925.

［14］LIU Z，CASTRILLON DH，ZHOU W，et al.FOXO1／3 depletion in granulosa cells alters follicle growth，death and regulation of pituitary FSH［J］.Mol Endocrinol，2013，27（2）：238－252.

［15］SHEN M，LIN F，ZHANG J，et al.Involvement of the upregulated FoxO1 expression in folliculargranulosa cell apoptosis induced by oxidative stress［J］.J Biol Chem，2012，287（31）：25727－25740.

［16］PARK Y，MAIZELS ET，FEIGER ZJ，et al.Induction of cyclin D2 in rat granulosa cells requires FSH-dependent relief from FOXO1 repression coupled with positive signals from Smad［J］.J Biol Chem，2005，280（10）：9135－9148.

（本文编辑：刘斯静）

EXPRESSION AND RELATIONSHIP OF FoxO GENE AND FOLLICLE STIMULATING HORMONE RECEPTOR GENE IN HUMAN OVARIAN GRANULOSA CELLS

LIANG Ying1，MI Meiyan2*，LI Shuxian2，ZHOU Li1，WU Xiaoqian1，LEI Lingmei3

（1.Department of Reproductive Center，the Fourth Hospital of Shijiazhuang City，Shijiazhuang 050011，China；2.Department of Gynaecology，the Fourth Hospital of Shijiazhuang City，Shijiazhuang 050011，China；3.Department of Clinical Laboratory，the Fourth Hospital of Shijiazhuang City，Shijiazhuang 050011，China）

ObjectiveTo explore the expression of forkhead box（FoxO）gene and folliclestimulating hormone receptor（FSHR）in human ovarian granulosa cells and their relationship.MethodsOne hundred and twenty-six unfertility women treated with in vitro fertilization and embryo transplantation（IVF-ET）were recruited.According to the pregnancy outcome，the patients were divided into pregnancy groups 63 cases and non-pregnancy group 63 cases.The expressions of FoxO1 mRNA，FoxO3a mRNA and FSHR mRNA on human ovarian granulosa cells were detected by real time fluorescence quantitative PCR.The correlation analysis of FoxO1，FoxO3a，FSHR with serum sex hormones including luteotropic hormone（LH），estradiol（E2），progesterone（P）were mevaluated.ResultsHigh quality embryo number and serum E2level in pregnancy group were significantly higher than those of non-pregnancy group（P＜0.01），butLH，P level and number of eggs showed no significant difference between two groups（P＞0.05）.The expression FoxO1 mRNA in pregnancy group was higher than that of non-pregnancy group（P＜0.01）.The expression of FoxO3a and FSHR mRNA were no statistical difference between pregnancy group and non-pregnancy group（P＞0.05）.The correlation coefficients of FoxO1 and FoxO3a with FSHR were 0.881，0.999（P＜0.01）.ConclusionFoxO1 and FoxO3a genes participate in the regulation of oocyte quality and their functions have closely connected with FSHR.

follicle stimulating hormone，human；cumulus cells；oocytes

R715.9

A

1007-3205（2014）10-1140-04

2014－06－27；

2014－08－19［基金项目］石家庄市科学技术研究与发展计划项目（11146753）［作者简介］梁莹（1975－），女，河北安新人，河北省石家庄市第四医院副主任医师，医学博士，从事生殖医学研究。

*通讯作者。E-mail：1604092700＠qq.com

10.3969／j.issn.1007-3205.2014.10.008