胃癌中hMSH2和PTEN的表达及临床意义

袁虎方，李 勇，檀碧波，赵 群，范立侨

（河北医科大学第四医院外三科，河北 石家庄 050011）

·论 著·

胃癌中hMSH2和PTEN的表达及临床意义

袁虎方，李 勇*，檀碧波，赵 群，范立侨

（河北医科大学第四医院外三科，河北 石家庄 050011）

目的 探讨人类mut-s同系物2（human mut-s homologue 2，hMSH2）和抑癌基因人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因（gene of phosphate and tension homology deleted on chromosome ten，PTEN）在胃癌组织中的蛋白表达及与临床病理特征之间的关系。方法 采用SP免疫组织化学法检测42例胃癌组织及其相应的近端癌旁组织（距癌组织3cm）、远端癌旁组织（距癌组织＞10cm）及15例正常胃组织hMSH2和PTEN蛋白表达；采用Western Blot半定量检测42例胃癌组织及相应远端癌旁组织（距癌组织＞10cm）hMSH2和PTEN蛋白表达。分析hMSH2和PTEN在胃癌组织中的蛋白表达与临床病理特征之间的关系。结果 胃癌组织中 hMSH2和PTEN蛋白表达缺失率明显高于近端癌旁组织、远端癌旁组织及正常胃组织（P＜0.05或＜0.01）。PTEN蛋白表达缺失率与肿瘤分化程度负相关（rs＝－0.707，P＜0.05），与TNM分期、浸润深度、淋巴结转移呈正相关（rs＝0.748、0.979、0.850、0.877，P＜0.05）。hMSH2和PTEN蛋白表达在胃癌中呈正相关。在胃癌组织中错配修复基因hMSH2蛋白表达缺失伴有PTEN蛋白表达下调。结论 PTEN表达与胃癌临床病理特征相关；在胃癌发生发展过程中错配修复蛋白hMSH2表达缺失伴有PTEN蛋白表达下调。

胃肿瘤；基因表达；疾病特征

胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，近年来发病率逐渐上升，并呈现年轻化趋势。对胃癌有关癌基因、抑癌基因的改变进行研究，有助于加深理解胃癌生物学本质的认识，为探讨胃癌发生发展机制及指导临床治疗提供理论依据。已有研究发现，错配修复基因（mismatch repair，MMR）——人类mut-s同系物2（human mut-s homologue 2，hMSH2）［1］以及抑癌基因人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因（gene of phosphate and tension homology deleted on chromosome ten，PTEN）［2］均与胃癌的发生发展密切相关［3－4］。但两者在胃癌的发生发展及转移中有无相互影响鲜有报道。本研究探讨hMSH2和PTEN在胃癌的发生发展及转移中作用以及相互关系，旨在为胃癌临床诊断、恶性程度评估以及预后分析提供参考。

1 材料与方法

1.1 标本采集：2010年1月—2011年12月在我院接受治疗的原发性胃癌患者42例，取患者癌组织、近端癌旁组织（距癌组织3cm）、远端癌旁组织（距癌组织＞10cm）及15例正常胃组织（为外伤、溃疡病、息肉同期在我院住院手术切除的或内镜活组织检查的非肿瘤胃组织）标本各 2份。1份迅速放入－80℃冰箱中以保持新鲜备用，另1份经10%福尔马林溶液固定、石蜡包埋备用。所取胃癌原发灶标本均经病理医师确诊。胃癌患者男性34例，女性8例，年龄37～75岁，平均（63.2±2.05）岁；高中分化癌16例，低未分化癌26例；侵透浆膜18例，未侵透浆膜24例；有淋巴结转移20例，无淋巴结转移 22例。TNM分期Ⅰ＋Ⅱ期 26例，Ⅲ＋Ⅳ期 16例。术前均未进行放、化疗等抗肿瘤措施。所有标本均为手术切除的新鲜标本。正常对照组患者15例，男性9例，女性 6例，年龄 18～62岁，平均（47.18± 5.62）岁；腹部外伤胃破裂修补术1例，溃疡病2例，胃息肉12例。

1.2 主要试剂：hMSH2兔抗人多克隆抗体购自Biolegend公司，工作浓度 1∶100；PTEN兔抗人多克隆抗体购自 Biolegend公司，工作浓度 1∶50；SP免疫组织化学试剂盒、DAB试剂盒均购于北京中杉生物技术公司。Tris-Hcl工作浓度 50mmol／L； NP40购自华美生物工程公司，工作浓度1%；脱氧胆酸钠工作浓度0.5%SDS工作浓度0.1%；Aprotinin购自Amrcsco公司，工作浓度10mg／L；预染蛋白标准购自美国Fermentas公司；考马斯亮蓝蛋白定量试剂盒购自南京建成生物试剂公司；蛋白酶K购自拜昂生物技术有限公司。

1.3 SP免疫组织化学检测：将收集的标本经100g／L中性甲醛固定，常规石蜡包埋后制成3～4μm连续切片，按试剂盒说明书进行免疫组织化学染色，DAB显色，苏木精复染后，中性树胶封片。取已知阳性组织作阳性对照，以PBS代替一抗作为阴性对照。hMLH2和PTEN在正常胃组织中高表达，hMLH2胞浆及胞核均着色。PTEN以胞浆着色为主。细胞核和（或）胞浆染成棕黄色颗粒为阳性表达。阳性细胞计数方法，高倍镜下（400倍）每张组织切片记数5个视野，每个视野计数100个细胞，取阳性细胞数百分比的平均值。阳性细胞数占11%～50%时为低表达，51%～100%为高表达。若切片中阳性细胞数≤10%时为表达缺失。计算hMSH2、PTEN蛋白在胃癌及其近端癌旁组织、远端癌旁组织和正常对照组织表达缺失率，缺失率＝阴性例数／总例数。

1.4 Western Blot检测：①提取组织总蛋白，剪碎组织，PBS漂洗2遍。加裂解缓冲液作用10min，制成匀浆。离心取上清液，用考马斯亮蓝蛋白定量试剂盒定量分析，每次检测前用β-actin抗体标准化监测。②配置SDS-PAGE，标本上样。③10 mA稳流条件电泳3h。④转膜，5%脱脂奶粉封闭3h。⑤加一抗，4℃过夜，TTBS漂洗3次；加二抗，37℃ 1h，TTBS漂洗3次。⑥DAB显色，采用凝胶分析系统进行照相、分析。凝胶成像系统（UVP，美国）LabWorks 4.5软件对蛋白表达行半定量分析，以积分光密度（integrated optical density，IOD）值表示。以相对IOD值比较蛋白表达高低。相对IOD值＝hMSH2和PTEN蛋白的IOD值／相应βactin蛋白的IOD值。判定标准，以正常组织相对 IOD值作为参照标准，计算 95%参考值范围，对癌组织相对IOD值进行判断，低于下限则判为低表达，高于上限则判为高表达。

1.5 统计学方法：应用SPSS 17.0统计软件进行数据处理。计数资料以百分率表示，采用χ2检验和秩和检验；相关性采用Spearman等级相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 免疫组织化学法检测hMSH2与PTEN蛋白表达：hMSH2在胃癌组织表达（图1）缺失率明显高于在近端癌旁组织、远端癌旁组织、正常胃组织（图2），近端癌旁组织、远端癌旁组织和正常胃组织间表达缺失率差异无统计学意义（P＞0.05）。PTEN在胃癌组织表达（图3）缺失率高于近端癌旁组织、远端癌旁组织、正常胃组织表达（图 4）缺失率（P＜0.05），而近端癌旁组织、远端癌旁组织和正常胃组织间表达缺失率差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 hMSH2、PTEN蛋白在各组组织中的表达Table 1 Expressions of hMSH2 and PTEN in different tissues （n）

hMSH2表达缺失率在患者的不同性别、年龄、肿瘤发生部位、肿瘤分化程度、浆膜侵犯程度、TNM分期、有无淋巴结转移间差异无统计学意义（P＞0.05）。PTEN表达缺失率在患者的不同性别、年龄、肿瘤发生部位间差异无统计学意义（P＞0.05），在肿瘤低分化程度、侵犯浆膜、TNM分期Ⅲ＋Ⅳ期、有淋巴结转移组较相应组表达缺失率高，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 hMSH2和PTEN蛋白表达与临床病理特征之间的关系Table 2 Relationship of hMSH2 and PTEN expressions with pathological features （n）

表2 （续）

PTEN表达缺失率与肿瘤分化程度呈负相关（rs＝－0.707，P＜0.05），与侵犯浆膜程度、TNM分期、淋巴结转移呈正相关（rs＝0.748、0.979、0.850，P＜0.05）。

2.2 Western Blot法检测胃癌组织 hMSH2和PTEN蛋白表达：β-actin、hMSH2、PTEN蛋白相对分子质量为42 000、110 000、55 000，Western Blot杂交后分别在42 000、110 000、55 000位置出现阳性条带。采用凝胶成像分析系统对杂交条带进行半定量分析，蛋白含量以IOD表示。每次检测蛋白时均检测β-actin蛋白，以其为标准对所检测hMSH2、PTEN蛋白进行定量。与对照组织相比例胃癌组织中hMSH2蛋白 21例呈低表达，其低表达率为50.00%。胃癌组低表达率明显高于远端癌旁组织（0／42），差异有统计学意义（P＜0.05）；远端癌旁组织中1例（1／42，2.38%）PTEN蛋白低表达，42例胃癌组织中 17例（40.48%）PTEN蛋白低性表达。胃癌组低表达率高于远端癌旁组织，差异有统计学意义（χ2＝18.101，P＜0.01）。

在胃癌组织中hMSH2与PTEN蛋白表达呈正相关（免疫组织化学检测中rs＝0.679，Western Blot法检测中rs＝0.816，P＜0.05）。错配修复蛋白hMSH2表达缺失常伴有PTEN蛋白表达缺失。

3 讨 论

近几年来，随着癌基因和抑癌基因的发现，对肿瘤的认识已经提高到分子水平。多种癌基因、抑癌基因表达的蛋白在细胞周期的过程中发挥着关键的调节作用，它们之间相互协调，共同维持着细胞周期的正常进行。当它们的功能失调时，细胞周期也会随即出现异常，从而导致肿瘤的发生。因此，癌基因、抑癌基因与许多肿瘤的发生发展密切相关。

错配修复基因是癌基因和抑癌基因的上游调节基因，通过修复碱基错配、小片段插入或缺失等DNA损伤和基因结构异常而降低基因突变率，维持基因组和遗传信息的稳定性［5］。所以，作为MMR基因中的 hMSH2基因极有可能会对抑癌基因PTEN产生影响，hMSH2识别碱基错配的能力下降，使失活的PTEN基因得不到有效修复，导致肿瘤的发生。这可能就是本研究中hMSH2与PTEN呈正相关的结果理论基础。

hMSH2基因是第1个被发现并分离的人类错配修复基因，位于染色体2p21～22，基因组DNA全长约73kb，含16个外显子。hMSH2可能通过以下3个途径起作用：增加癌基因和或抑癌基因的突变率［6－7］；错配修复功能缺陷；通过化学物质使细胞损伤导致肿瘤发生。

PETN是迄今第1个被发现的具有磷酸酶活性的抑癌基因。PTEN通过诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡等抑制肿瘤发生发展，其突变和异常表达与多种肿瘤的发生发展、浸润、转移显著相关，是患者预后不良的标志。PTEN基因表达缺失可促进胃癌血管生成，并在胃癌的进展和转移中起关键作用；其表达下调在胃癌的发生、进展、生长、分化和血管生成中起重要作用。

本研究通过免疫组织化学检测hMSH2、PTEN蛋白的表达，结果显示，胃癌组织中hMSH2蛋白的表达缺失率显著高于近端癌旁组织、远端癌旁组织及正常胃组织。与文献报道［8］一致。提示胃癌的发生可能与错配修复基因的突变有关，错配修复基因的突变引起错配修复酶的缺乏，从而发生微卫星不稳定性（microsatellite instability，MSI），导致胃癌的发生，这可能是部分胃癌发生的病理基础；但其表达与患者的性别、年龄、肿瘤部位、分化程度、浆膜侵犯程度、TNM分期和有无淋巴结转移均无相关性。提示胃癌hMSH2蛋白表达的特性可能在细胞恶变时即已形成，不随癌细胞的分化和生长情况而改变。

PTEN可以多途径地抑制肿瘤的浸润和转移，其中稳定和增强肿瘤细胞间的黏附起着至关重要的作用。PTEN以E-钙黏蛋白依赖性方式诱导细胞聚集、抑制细胞的离散和浸润表型。异位表达的PTEN能诱导细胞聚集，抑制细胞的离散和浸润表型，但E-钙黏蛋白失活后，PTEN诱导细胞聚集、抑制细胞离散和浸润表型的作用消失［9］。本研究发现胃癌组织中PTEN蛋白的表达缺失率显著高于近端癌旁组织、远端癌旁组织及正常胃组织；PTEN表达缺失率与分化程度、浆膜侵犯程度、TNM分期和有无淋巴结转移呈负或正相关。提示PTEN蛋白表达缺失可能与胃癌的侵袭转移能力密切相关。

本研究还采用 Western Blot检测 hMSH2和PTEN在胃癌组织和远端瘤旁组织的蛋白表达，其表达结果与免疫组织化学结果一致，2个基因的蛋白在胃癌组织中的表达水平远低于远端瘤旁组织，两者呈正相关。也就是说，胃癌组织中hMSH2和PTEN基因的表达缺失率高于远端瘤旁组织；有hMSH2蛋白表达缺失率高的胃癌组织常伴有PTEN表达缺失率增高。

分析抑癌基因hMSH2和PTEN在胃癌组织中的表达缺失情况及其间的关系有助于了解胃癌的发病机制，hMSH2表达异常和PTEN表达下调可能与胃癌的发生有关。

总之，PTEN表达与其临床病理特征相关；在胃癌发生发展过程中错配修复基因hMSH2蛋白表达缺失伴有PTEN蛋白表达下调。hMSH2与PTEN联合检测对胃癌的病因学研究、肿瘤恶性程度、转移潜能的评估有着重要的意义。可作为判断胃癌转移、预后和制定治疗方案的一个联合型分子生物学的观测指标，对于此类高表达的患者，我们可以给予更为积极有针对性的综合治疗。（本文图见封二）

［1］GOODFELLOW PJ.Clinicopathologic significance of DNA mismatch repair defects in endometrial cancer：the devil is in the details［J］.Gynecol Oncol，2009，113（2）：151－152.

［2］TANWAR PS，MOHAPATRA G，CHIANG S，et al.Loss of LKB1 and PTEN tumor suppressor genes in the ovarian surface epithelium induces papillary serous ovarian cancer［J］.Carcinogenesis，2014，35（3）：546－553.

［3］XIONG HL，LIUXQ，SUNAH，etal.AberrantDNA methylation of P16，MGMT，hMLH1 and hMSH2 genes in gombination with the MTHFR C677T genetic polymorphism in gastric cancer［J］.Asian Pac J Cancer Prev，2013，14（5）：3139－3142.

［4］赵雪峰，焦志凯，李勇，等.胃癌中PTEN、IGF-1、IGF-1R蛋白表达及其预后意义评价［J］.第三军医大学学报，2008，30（12）：1197－1199.

［5］韩彩丽，郝军，高蔚娜，等.大肠癌中错配修复酶 hMLH1、hMSH2及环氧化酶-2表达的研究［J］.河北医科大学学报，2004，25（5）：266－269.

［6］HASTY P，CHRISTY BA.p53 as an intervention target for cancer and aging［J］.Pathobiol Aging Age Relat Dis，2013，8：3.

［7］PAULAG，CHANDRAN B，SHARMA-WALIA N.Cyclooxygenase-2-prostaglandin E2-eicosanoid receptor inflammatory axis：a key player in Kaposi＇s sarcoma-associated herpes virus associated malignancies［J］.Transl Res，2013，162（2）：77－92.

［8］宋伟庆，韩彩丽，闫庆辉，等.胃癌中还氧化酶和错配修复酶的研究［J］.中华实验外科杂志，2004，21（11）：1401.

［9］FATA JE，DEBNATH S，JENKINS EC JR，et al.Nongenomic Mechanisms of PTEN Regulation［J］.Int J Cell Biol，2012，2012：379685.

（本文编辑：赵丽洁）

本刊对修改文稿中插图的要求

为确保本刊的印刷质量，本刊对修改文稿中插图的要求规定如下。

一、对照相图片的要求：无论黑白图片还是彩色图片，均需以电子文件JPG格式或JPEG格式随修改文稿正文发送至hbydxbxg＠126.com邮箱。主题写：稿号插图（例如：03080268插图）。

二、对线条图的要求：线条图请用Illustrator 1.0以上版本绘制，线条用0.2mm粗的线，文字数据需用6号字以上。发送修改文稿正文时将线条图一并发至hbydxbxg＠126.com邮箱。

以上要求请尽力做到，如有疑问请与我部联系。联系电话：（0311）86266109。

谢谢合作！

《河北医科大学学报》编辑部

EXPRESSION OF hMSH2 AND PTEN IN SPORADIC GASTRIC CARCINOMA

YUAN Hufang，LI Yong*，TAN Bibo，ZHAO Qun，FAN Liqiao
（Third Department of Surgery，the Fourth Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang050011，China）

ObjectiveTo investigate the expression of human mut-s homologue 2（hMSH2）and phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten（PTEN）in sporadic gastric carcinoma，and thereby to elucidate their relationship and clinical significance.Methods

The expression levels of hMSH2 and PTEN were detected using immunohistochemistry in 42 cases with sporadic gastric carcinoma，its corresponding adjacent tissues（3cm away from cancerous tissues），distal tissues（from cancer＞10cm）and 15 cases of normal gastric tissues.The expression levels of hMSH2 and PTEN protein were analyzed using Western Blot in 42 patients with sporadic gastric carcinoma and its corresponding distal controls.ResultsLoss rate of expression of hMSH2 and PTEN in gastric cancer were higher than that of proximal tumoradjacent gastric carcinoma tissues，distal tumor-adjacent gastric carcinoma tissues and normal gastric tissues（P＜0.05 orP＜0.01）.PTEN loss rate showed negative correlation with the degree of tumor differentiation（rs＝－0.707，P＜0.05），but positive correlation with TNM staging，invasive depth，and lymph node metastasis（P＜0.05）.hMSH2 and PTEN were positive correlated in gastric cancer.There was a decreasing expression in expression losses of mismatch repair geneand hMSH2.ConclusionPTEN protein expression is correlated with clinic and pathological features.The expression deletion of mismatch repair protein hMSH2 was accompanied by downregulated PTEN protein expression in sporadic gastric carcinoma.

stomach neoplasms；gene expression；disease attributes

R735.2

A

1007-3205（2014）10-1121-05

2014－04－02；

2014－05－09

袁虎方（1978－），男，河北邯郸人，河北医科大学第四医院副主任医师，医学博士研究生，从事消化系统疾病诊治研究。

*通讯作者

10.3969／j.issn.1007-3205.2014.10.002