来氟米特对实验性变态反应性脑脊髓炎小鼠T细胞亚群及Th1型细胞因子的影响

袁正洲，李作孝，马勋泰，罗斌，胡高云，杨波，陈琪

(泸州医学院附属医院神经内科1、介入科2、肝胆外科3，四川泸州 646000)

来氟米特对实验性变态反应性脑脊髓炎小鼠T细胞亚群及Th1型细胞因子的影响

袁正洲1，李作孝1，马勋泰1，罗斌2，胡高云2，杨波2，陈琪3

(泸州医学院附属医院神经内科1、介入科2、肝胆外科3，四川泸州 646000)

目的探讨来氟米特(Leflunom ide，LEF)对实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)小鼠模型发病防治作用及可能的免疫学机制。方法将30只雌性C57BL/6小鼠随机分为EAE对照组及高、低剂量LEF防治组，每组10只。通过注射髓鞘少突胶质细胞糖蛋白35-55(MOG35-55)免疫介导构建EAE模型。从造模前3 d开始起EAE对照组及高、低剂量LEF防治组分别予以生理盐水8mg/(kg·d)、LEF 2mg/(kg·d)灌胃，连续10 d。观察小鼠发病情况及外周血中T细胞亚群及IFN-γ、IL-2水平的变化。结果LEF各防治组小鼠临床症状较轻，发病高峰期外周血T细胞亚群CD4+、CD8+分布比例较EAE对照组明显升高(P＜0.01)，CD4+/CD8+值明显降低(P＜0.01)；发病高峰期外周血IL-2、INF-γ含量较EAE对照组明显降低(P＜0.01)，且高剂量降低更明显(P＜0.01)。结论LEF对EAE具有防治作用，效果与LEF剂量有关，其防治作用可能与调节T淋巴细胞亚群分布及抑制IFN-γ、IL-2水平有关。

实验性变态反应性脑脊髓炎；多发性硬化；来氟米特；T细胞亚群；Th1型细胞因子

多发性硬化(Multiple sclerosis，MS)是一种以中枢神经系统(Centralnervous system，CNS)不同部位及不同程度白质脱髓鞘为主要病理特征的自身免疫性疾病[1]。患者大多遗留不同程度的后遗症而影响生活质量。来氟米特(Leflunom ide，LEF)是人工合成的嗯唑类化合物，作为一种新型的免疫抑制剂最早应用于器官移植[2]。LEF也已用于自身免疫性疾病的治疗，除对类风湿性关节炎疗效显著外，在全身性红斑狼疮、肾小球疾病、皮肤疾病等治疗中也取得了较好的治疗疗效，且药物不良反应较小[3]。目前国内外未见其用于防治MS及其动物模型EAE的报道。本研究探讨LEF对MS的动物模型EAE是否具有防治作用及其对T细胞亚群及Th1型细胞因子的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物雌性C57BL/6小鼠30只，6～8周龄，体重(20±2)g，购自四川大学华西实验动物中心，为一级合格动物。实验前在泸州医学院附属医院中心实验室常规饲养7 d。

1.2 实验药品及试剂来氟米特片(LEF)购自苏州长征-欣凯制药有限公司。髓鞘少突胶质细胞糖蛋白35-55多肽(MOG35-55)由上海强耀生物科技有限公司合成，纯度＞95%；福氏不完全佐剂(IFA)购自Sigma公司；百日咳毒素(PTx)购自A lexis公司；结核分枝杆菌H37Ra(MT)购自BD公司。T细胞亚群检测试剂盒(FITC-CD4/PE-CD8)购自COULTER公司；细胞因子IL-2ELISA检测试剂盒购自北京华英生物技术研究所产品；IFN-γELISA试剂盒购自晶美生物工程有限公司。

1.3 方法

1.3.1 EAE模型制作小鼠通过随机数字表随机分为三组：EAE对照组及高、低剂量LEF防治组，每组10只。将MOG35-55及结核分枝杆菌H37Ra (MT)溶解于IFA中制成免疫抗原，其中每毫升抗原含1mg MOG35-55及4mg结核分枝杆菌。在小鼠后背中线两侧分四点注入免疫抗原，每只注入0.2m l。在造模后当天及第2天，每只小鼠腹腔注射PTx 200 ng加强免疫反应。

1.3.2 模型干预从造模前3 d开始起每天高、低剂量LEF组分别予以LEF片8mg/(kg·d)、2mg/(kg·d) (用2m l注射用生理盐水溶解)灌胃；EAE对照组每日2m l生理盐水灌胃，连续10 d。

1.3.3 动物模型评价每日定时对实验C57BL/6小鼠进行神经功能障碍评分。评分标准：0分，未发病；1分，后肢轻度无力(包括尾巴无力)；2分，中度后肢无力或者轻度共济失调；3分，中至重度后肢无力；4分，严重后肢无力；5分，中度以下四肢无力的截瘫；6分，四肢全瘫或严重共济失调或者死亡[4]。

1.3.4 实验终止C57BL/6小鼠在发病高峰期(连续3 d症状评分无加重、四肢瘫痪或死亡时)处死，实验终止时取小鼠心脏动脉血2m l。

1.3.5 IL-2、IFN-γ水平及T细胞亚群CD4+、CD8+测定ELISA法测IFN-γ、IL-2含量，按照说明书操作，通过标准品吸光度值绘制标准曲线再计算各样本值。流式细胞仪测定外周血T细胞亚群CD4+、CD8+分布。

1.4 统计学方法计数资料采用率描述。计量资料以均数±标准差(x-±s)表示，两组间样本均数比较采用t检验，多组间样本均数比较，符合正态分布且方差齐时使用单因素方差分析(One-way ANOVA)，方差不齐或非正态分布时采用Kruskal-Wallis H检验(Kruskal-WallisH test)。统计学处理由SPSS19.0软件包分析完成。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 EAE对照组及LEF各防治组发病潜伏期、进展期及临床表现C57BL/6小鼠造模后主要表现为精神萎靡、活动减少、食欲减弱、体重下降等。注射抗原17 d左右，EAE小鼠逐渐出现单后肢或双后肢或伴前肢不同程度的无力、共济失调、瘫痪；而高、低剂量LEF组症状较EAE对照组明显减轻，表现为潜伏期天数延长、进展期缩短、神经功能障碍评分降低(P＜0.01或P＜0.05)，高剂量改善更明显(P＜0.01或P＜0.05)，见表1。

表1 EAE对照组及LEF各防治组发病潜伏期和进展期比较(±s)

表1 EAE对照组及LEF各防治组发病潜伏期和进展期比较(±s)

注：与EAE对照组比较，aP＜0.01，bP＜0.05；与小剂量LEF防治组比较，cP＜0.01，dP＜0.05。

组别神经功能障碍评分(分)例数潜伏期(d)进展期(d) EAE对照组低剂量LEF防治组高剂量LEF防治组H值P值4.22±1.13 3.45±1.33a3.05±0.75ad5.31＜0.01 10 10 10＜0.05 17.15±1.75 18.42±1.31b19.67±1.43ad5.62＜0.01 5.22±1.41 4.68±1.55b3.65±1.19ac6.74＜0.01

2.2 EAE对照组及LEF各防治组发病高峰期T细胞亚群分布变化LEF各防治组发病高峰期外周血T细胞亚群CD4+、CD8+分布比例较EAE对照组明显升高(P＜0.01)，CD4+/CD8+值明显降低(P＜0.01)；高剂量LEF防治组大鼠发病高峰期外周血CD4+、CD8+分布比例较低剂量LEF组明显增高(P＜0.01)，CD4+/CD8+值降低不明显(P＞0.05)，见表2。

表2 EAE对照组及LEF各防治组发病高峰期T细胞亚群CD4+、CD8+、CD4+/CD8+值(±s)

表2 EAE对照组及LEF各防治组发病高峰期T细胞亚群CD4+、CD8+、CD4+/CD8+值(±s)

注：与EAE对照组比较，aP＜0.01；与小剂量LEF防治组比较，bP＜0.01，cP＜0.05。

组别CD4+/CD8+例数CD4+(%)CD8+(%) EAE对照组低剂量LEF防治组高剂量LEF防治组H值P值2.57±0.04 1.88±0.11a1.86±0.09ac215.55＜0.01 10 10 10＜0.01 35.49±0.58 40.68±1.24a43.87±1.04ab226.11＜0.01 13.81±0.23 21.75±1.28a23.58±0.81ab428.88＜0.01

2.3 EAE对照组及LEF各防治组C57BL/6小鼠发病高峰期外周血IL-2、INF-γ含量变化LEF各防治组发病高峰期外周血IL-2、INF-γ含量较EAE对照组明显降低(P＜0.01)；高剂量LEF防治组C57BL/6小鼠发病高峰期外周血IL-2、INF-γ含量较低剂量LEF防治组低(P＜0.01)，见表3。

表3 EAE对照组及LEF各防治组C57BL/6小鼠发病高峰期外周血IL-2、INF-γ含量变化(±s)

表3 EAE对照组及LEF各防治组C57BL/6小鼠发病高峰期外周血IL-2、INF-γ含量变化(±s)

注：与EAE对照组比较，aP＜0.01；与小剂量LEF防治组比较，bP＜0.01。

组别INF-γ(ng/m l)例数IL-2(ng/m l) EAE对照组低剂量LEF防治组高剂量LEF防治组H值P值15.14±1.10 12.77±0.51a11.42±0.86ab56.17＜0.01 10 10 10 23.37±1.19 13.96±1.18a9.45±0.52ab137.32＜0.01

3 讨论

MS是中枢神经系统炎性脱髓鞘疾病，是遗传易患个体与环境因素相互作用而发生的自身免疫所介导的疾病。MS患者具有多个异常的免疫环节，包括自身抗体破坏髓鞘以及自身反应性T细胞激活，同时MS患者脑脊液、外周血以及脑组织中出现多种活化反应性T细胞。自20世纪中叶，Kabat等在成功地造出MS的动物模型EAE以来，EAE造模动物发展种类繁多，猴、大鼠、C57BL/6小鼠等均有报道[5]。C57BL/6小鼠是用来建立MS模型的理想品系，但由于其价格较高，且造模过程中抗原及百日咳毒素价格不菲同时不易获取，国内较少使用，而国际上普遍采用C57BL/6小鼠构建稳定的模型[6]。

LEF是美国FDA批准用于类风湿关节炎治疗的一种新型免疫抑制剂。作为一种新型的免疫抑制剂最早应用于器官移植，LEF同时也已用于自身免疫性疾病的治疗[7]。LEF通过抑制抑制淋巴细胞活化及由此而致的免疫反应。本实验选择8mg/(kg·d)、2mg/(kg·d)两种剂量LEF对EAE小鼠进行干预，发现LEF通过发挥其抗炎功能，能够延长EAE发病潜伏期、缩短进展期、减轻神经功能障碍评分，对EAE有保护作用且剂量依赖关系作用效果明显。

在MS的诸多发病机制中，由于体内免疫平衡被打破，从而引发的自身免疫性疾病被认为是最重要的一种机制[8]。T淋巴细胞参与细胞免疫的，根据T淋巴细胞表面的抗原不同可分为CD4+以及CD8+两类细胞[9]。T细胞在脱髓鞘中起重要作用，在MS患者脑组织病灶中发现大量的CD4+和CD8+T细胞，在有针对性地去除EAE大鼠的CD4+Th细胞后，EAE大鼠病情有所缓解乃至恢复正常[10]。如果去除了大鼠的CD4+T细胞，则可以导致大鼠对EAE产生抵抗。对猴实验性变态反应性脑脊髓炎血和脑脊液T淋巴细胞亚群动态观察发现，急性期猴EAE血中CD4+/CD8+明显升高，猴EAE发病后脑脊液CD4+T细胞在急性期比血中CD4+T细胞升高更明显，CD4+/CD8+明显比发病前高，证实了EAE是CD4+T细胞介导为主的免疫紊乱。推测EAE发病时存在CD4+T、CD8+T等免疫活性细胞增殖能力下降：EAE动物存在T细胞亚群分布异常、CD4+/CD8+值倒置。本研究结果显示：EAE组发病高峰期外周血T细胞亚群CD4+、CD8+分布比例较LEF防治组明显降低，CD4+/CD8+值明显增高。提示EAE发病与CD4+、CD8+分布比例降低、CD4+/CD8+值增高有关。LEF可能通过提高EAE大鼠CD4+、CD8+分布比例和降低CD4+/CD8+值，纠正T细胞亚群分布异常从而发挥对EAE的保护作用。其保护作用与剂量有关，高剂量作用更为明显。

根据其分泌不同的细胞因子，CD4+T细胞又被分为Thl、Th2等细胞。Thl细胞主要分泌IL-2、IFN-γ等。通常情况下，机体产生的细胞因子较少，在受到抗原、细胞因子以及内毒素等刺激后能够迅速产生大量细胞因子[11]。有研究显示中枢神经系统的IL-2 mRNA及蛋白在EAE在恢复期降低，而在诱导期以及急性期增高。用基因敲除IL-2的C57BL/6小鼠来造EAE模型，实验显示未敲除的野生型小鼠全部发病，而敲除IL-2的小鼠仅有23%的造模成功率[12]。证实了IL-2缺乏的C57BL/6小鼠对EAE易感性下降。IFN-γ协同TNF-α上调星形细胞对MHCII类分子的表达，促进抗原递呈，加速炎症反应的启动。本研究发现LEF各防治组发病高峰期外周血IL-2、INF-γ含量较EAE对照组明显降低，高剂量LEF防治组外周血IL-2、INF-γ含量较低剂量LEF防治组低，与既往研究结果相似。

综上所述，LEF能够延长EAE发病潜伏期、缩短进展期、减轻神经功能障碍评分，对EAE具有保护作用，且剂量依赖关系作用效果明显。其保护作用可能与提高EAE大鼠CD4+、CD8+分布比例和降低CD4+/ CD8+值，纠正T细胞亚群分布异常以及降低Th1型细胞因子IL-2、IFN-γ有关。LEF为防治MS提供了新的研究方向，而其在MS患者中的安全有效性还有待于进一步研究。

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Effect of leflunom ide on Tcell subsetsand Th1-type cytokines in experimental allergic encephalom yelitism ice.

YUAN Zheng-zhou1,LIZuo-xiao1,MAXun-tai1,LUO Bing2,HU Gao-yun2,YANG Bo2,CHEN Qi3.Departmentof Neurology1,Department of Interventional Therapy2,Department of Hepatobiliary Surgery3,the Affiliated Hospital of Luzhou MedicalCollege,Luzhou 646000,Sichuan,CHINA

Objective To investigate the effectof leflunom ide(LEF)on experimental allergic encephalomyelitis(EAE)m ice and the possible immunologicalmechanism s.MethodsThirty female C57BL/6m icewere randomly divided into EAE control group,high and low dose leflunom ide treatment group,w ith n=10 in each group.EAE model w as built by injection of myelin oligodendrocyte glycoprotein 35-55(MOG35-55).From three days before modeling,the control group,the high dose treatment group,and low dose treatmentgroup were feed saline,leflunomide 8mg/(kg·d),leflunomide2mg/(kg·d)for 10 days,respectively.Incidencewas observed inm ice and peripheral blood T cell subsets and IFN-γ,IL-2 levelswere detected.ResultsEach treatment group havemild clinical symptoms,and peripheral blood T cell subsets CD4+,CD8+distribution rateswere significantly higher than EAE control group(P＜0.01),while CD4+/CD8+valuewas lower(P＜0.01).The peripheralblood IL-2,INF-γlevels in high and low dose treatmentgroup were significantly lower than EAE control group(P＜0.01),and the reduction in high dose treatment group wasmore significant(P＜0.01).ConclusionLeflunom ide has preventive effect on EAE,and the effect is dose related w ith the leflunom ide.Its preventive effectmay be related to the regulation of T lymphocyte subsets and inhibition of IFN-γ,IL-2.

Experimental allergic encephalomyelitis;Multiple sclerosis;Leflunom ide;T cell subsets;Th1 type cytokines

R-332

A

1003—6350(2014)04—0480—04

2013-10-28)

泸州市科技创新苗子培育计划项目[编号：2013-R-51(8/18)]

李作孝。E-mail：lzx3235@sina.com

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.04.0186