2种培养基对碳青霉烯类药物抗非发酵菌体外药敏检测结果的影响

金波+叶岩荣

摘 要 目的：评估低氨基酸培养基和MH培养基对碳青霉烯类药物抗非发酵菌体外药敏检测结果的区别。方法：采用琼脂稀释法分别使用MH和低氨基酸培养基测定亚胺培南、美罗培南、帕尼培南等10种抗菌药物对我院临床分离60株铜绿假单胞菌和140株鲍曼不动杆菌的最低抑菌浓度（MIC），比较其结果的差异。结果：使用MH琼脂作为药敏培养基时，60株铜绿假单胞菌和140株鲍曼不动杆菌对亚胺培南、美罗培南和帕尼培南的敏感率分别为90%、85%和68.3%和15.7%、23.6%和15%；使用低氨基酸琼脂作为药敏培养基时，它们的敏感性分别上升到100%（P=0.272）、96.7%（P=0.053）、93.3%（P=0.001）和90.7%（P=0.001）、98.6%（P=0.001）和91.4%（P=0.001），其中铜绿假单胞菌对帕尼培南的敏感率上升有显著差异，而鲍曼不动杆菌对三者的敏感率上升均有显著差异。结论：我院分离的鲍曼不动杆菌对临床常用抗菌药物的耐药率较高。碳青霉烯类药物对铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌的抗菌活性高于其它类抗菌药物。低氨基酸培养基，由于其碱性氨基酸浓度降低至与人血清中相近的浓度，适宜用于帕尼培南体外敏感性测定。

关键词 碳青霉烯类 非发酵菌 体外药敏 低氨基酸培养基

中图分类号：R446.5 文献标识码：B 文章编号：1006-1533（2014）11-0019-04

Evaluation of the susceptibility of clinical

non-fermentative isolates to carbapenems on two kinds of media

JIN Bo*， YE Yanrong**

（Department of Pharmaceutical Preparation， Zhongshan Hospital， Fudan University， Shanghai 200032， China）

ABSTRACT Objective： To evaluate the effects of low-amino-acid agar and Mueller-Hinton （MH） agar on the susceptibility of clinical non-fermentative isolates to three carbapenems. Methods： The activities of imipenem， meropenem， panipenem and so on were tested against 40 Pseudomonas aeruginosa and 160 Acinetobacter baumannii strains isolated from our hospital. The minimum inhibitory concentration （MIC） of each antimicrobial agent against these strains was determined by a standard agar dilution procedure on the MH and low-amino-acid agars， respectively. Results： The susceptibility of P. aeruginosa and A. baumannii to imipenem， meropenem， panipenem was 90%， 85%， 68.3% and 15.7%， 23.6% ， 15%， respectively when they were incubated on MH agar， however， their susceptibility was enhanced to 100% （P=0.272）， 96.7% （P=0.053）， 93.3% （P=0.001）and 90.7% （P=0.001）， 98.6% （P=0.001） and 91.4% （P=0.001） on low-amino-acid agar， respectively， which were statistically significant. Conclusion： Carbapenems had good antibacterial activity in vitro against P. aeruginosa and A. baumannii. Low concentrations of basic amino acid medium should be used in order to get consistent result between in vitro susceptibilities and clinical effect of panipenem against P. aeruginosa..

KEY WORDS carbapenems； non-fermentative isolates； in vitro susceptibilities； low-amino-acid agar

碳青霉烯类抗菌药物于20世纪90年代初开始用于临床，由于其对β内酰胺酶较强的稳定性，对几乎所有的肠杆菌科细菌具强大的抗菌作用，是治疗产超广谱β内酰胺酶（ESBLs）、头孢菌素酶（AmpC）等多重耐药革兰阴性杆菌包括某些非发酵菌所致感染的重要药物[1]。但近年来随着碳青霉烯类药物的广泛使用，耐碳青霉烯类菌株、特别是非发酵菌耐药菌株的不断增加，给临床治疗带来极大的困难，而采用不同的培养基测试它们的药敏结果有不小差异[2]。为确切了解在我院目前碳青霉烯类与其它常用的抗菌药物对铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌的体外抗菌活性，我们在MH培养基上分别对临床分离的铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌检测了最低抑菌浓度（MIC），并对在2种不同培养基上测试的三种碳青酶烯类抗菌药物的抗菌活性进行了比较，为临床正确评价不同培养基上测试的药敏结果和合理选用抗菌药物提供依据和参考。

1 材料和方法

1.1 菌株

收集我院2010年1-9月不同标本来源的临床革兰阴性非发酵分离株200株作为受试菌株，其中铜绿假单胞菌60株、鲍曼不动杆菌140株。所有分离株都由凤凰全自动细菌鉴定药敏仪（Phoenix System，美国BD）鉴定通过。质控菌株采用大肠埃希菌ATCC25922和铜绿假单胞菌ATCC27953（购自上海市临床检验质控中心）。

1.2 抗菌药物

本研究所测试的10种抗菌药物均为标准品（购自中国食品药品检定研究院）。

1.3 培养基

MH培养基（购自英国Oxoid）作为目前临床微生物使用的常规药敏培养基；Davis 基础培养基（minimal agar Davis，购自美国BD）和酸 水解酪蛋白（ 购自美国Sigma）作为低氨基酸琼脂培养基，其配制方法为每升Davis基础培养基中加入4.5 g酸水解酪蛋白；哥伦比亚血平板（购自法国梅里埃）为细菌纯化分离培养基。

1.4 药敏试验方法

MIC测定采用琼脂稀释法药敏试验[3]。受试菌株均在血平板上传代1次，保证其纯度及活力，挑取单个菌落接种于90 mm的血平板上，用接种环涂布于整个平板，置于含5% CO2的二氧化碳培养箱于35 ℃孵育18 h。试验当日将生长的菌落悬浮于2 ml 0.85%灭菌生理盐水中，制备浓度为0.5个麦氏单位的菌悬液。稀释后使用多点接种仪将约1～2 ?l菌悬液点种在含有不同浓度抗菌药物的平板上，不加抗菌药物的平板作为阳性对照，细菌的最终接种浓度为104 CFU/点。所有平板置于含5% CO2的二氧化碳培养箱于35 ℃孵育18 h观察结果。

1.5 结果判读方法

肉眼观察细菌生长结果，与阳性对照比较抑制80%以上细菌生长的最低药物浓度作为该药的MIC值[3]。

1.6 数据计算和分析

根据MIC值，采用Whonet 5.4药敏统计分析软件计算MIC50、MIC90、耐药率、中敏率和敏感率，其中药敏结果折点参考2012年版CLSI，M100-S22[4]，帕尼培南的判断折点参考文献[5]，头孢哌酮/舒巴坦判断折点参考头孢哌酮[5]。

2 结果

2.1 在MH培养基上体外抗菌活性

10种抗菌药物对铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌的体外抗菌活性见表1。

2.2 在低氨基酸培养基上的体外抗菌活性

低氨基酸培养基能提高碳青霉烯类的抗菌活性，3种碳青霉烯类药物对铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌的体外抗菌活性见表2。使用卡方检验分析，铜绿假单胞菌对帕尼培南的敏感率显著上升，P<0.05具有统计学意义；鲍曼不动杆菌对三种碳青霉烯类药物的敏感率均显著上升，P<0.05具有统计学意义。

3 讨论

铜绿假单胞菌对碳青霉烯类的主要耐药机制，包括产生外排泵、获得编码β-内酰胺酶的基因和外膜通透性降低等。OprD是铜绿假单胞菌外膜上碱性氨基酸的结合位点，能够加速碱性氨基酸的扩散。由于碳青霉烯类在结构上与碱性氨基酸相似，因此OprD也是碳青霉烯类进入铜绿假单胞菌的通道。OprD缺失会主要导致这两种细菌对亚胺培南耐药，但对美罗培南敏感性的降低程度比较有限[6].

国外有研究表明降低MH琼脂培养基中的基础氨基酸浓度可以增强铜绿假单胞菌外膜D2孔蛋白通道运送碳青霉烯类抗菌药的能力，有利于其进入细菌从而提高抗铜绿假单胞菌活性[6]。Fukuoka等[7]报道，帕尼培南和亚胺培南在人血清中抗假单胞菌的活性远高于MH培养基，而在人血清中加入碱性氨基酸，其活性则会显著降低。Muramatsu等[8]研究表明，帕尼培南、亚胺培南和美罗培南中帕尼培南的MIC受碱性氨基酸影响最大。萧晨路等[9]研究发现低氨基酸培养基能够增强碳青霉烯类尤其是帕尼培南的抗假单胞菌的活性，而目前临床微生物实验室通常采用的药敏培养基MH会降低铜绿假单胞菌对帕尼培南的体外敏感性，本研究证实这一结果，其中帕尼培南的抗菌效果上升显著，铜绿假单胞菌在低碱培养基中对帕尼培南的耐药率及MIC50/MIC90分别为0%和（0.032/2）。本研究还发现鲍曼不动杆菌在低氨基酸的培养基中对碳青霉烯类药物的敏感性也显著上升，这与国外研究结果相差较大，是否和本院分离的鲍曼不动杆菌耐药机制独特性有关，需进一步研究证实原因。

综上所述，由于目前临床微生物实验室通常采用的药敏培养基MH中含有高浓度的碱性氨基酸，会对碳青霉烯类药物，尤其是帕尼培南的体外药敏检测结果造成影响，因此可能需要根据测试细菌的种类对药敏培养基中碱性氨基酸浓度进行调整。针对铜绿假单胞菌对帕尼培南的体外药敏检测，宜采用低浓度氨基酸培养基进行测定，这样得到的结果更能符合人体内实际情况。

参考文献

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[3] Clinical and Laboratory Standards Institute. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically[EB/OL]. [2013-10-10]. http：//ebookbrowsee.net/cl/clsi-m07-a8#.U0jDNeZWQoM.

[4] Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing， Twenty-Second Informational Supplement[EB/OL]. [2013-10-10]. http：//antimicrobianos.com.ar/ATB/wp-content/uploads/2012/11/M100S22E.pdf.

[5] 黄瑶， 徐英春， 胡云建， 等. SENANIR监测中国15所教学医院不发酵糖革兰阴性杆菌对13种抗菌药物的药敏[J]. 中国感染与化疗杂志， 2012， 12（4）： 268-275.

[6] Calandra G， Lydick E， Carrigan J， et al. Factors predisposing to seizures in seriously ill infected patients receiving antibiotics： experiences with imipenem/cilastatin[J]. Am J Med， 1988， 84（5）： 911-918.

[7] Fukuoka T， Ohya S， Narita T， et al. Activity of the carbapenem panipenem and role of the OprD （D2）protein in its diffusion through the Pseudomonas aeruginosa outer membrane[J]. Antimicrob Agents Chemother， 1993， 37（2）： 322-327.

[8] Murmatsu H， Horii T， Morita M， et al. Effect of basic amino acids on susceptibility to carbapenems in clinical Pseudomonas aeruginosa isolates[J]. Int J Med Microbiol， 2003， 293（2-3）： 191-197.

[9] 萧晨路， 韩立中， 孙景勇， 等. 鲍曼不动杆菌及铜绿假单胞菌体外抗菌活性的分析及培养基的影响[J]. 检验医学， 2011， 26 （9）： 582-585.

（收稿日期：2013-12-12）