大豆异黄酮对成骨细胞增殖活性的测定和BGP mRNA的表达

宋 梅 王淑芳 黄永凯 王红梅

（武警内蒙古总队医院肾内科，内蒙古 呼和浩特 010010）

大豆异黄酮对成骨细胞增殖活性的测定和BGP mRNA的表达

宋 梅 王淑芳 黄永凯 王红梅

（武警内蒙古总队医院肾内科，内蒙古 呼和浩特 010010）

目的研究不同浓度的大豆异黄酮对体外培养大鼠成骨细胞增殖活性和骨钙素（BGP）基因表达的影响。方法采用新生大鼠颅骨分离培养成骨细胞，加入不同浓度的大豆异黄酮（20、40、60、80 μg/μL），另设空白对照组。MTT法测成骨细胞增殖活性。提取细胞总RNA，RT-PCR半定量分析细胞BGP mRNA表达。结果MTT结果显示，60和80 μg/μL组成骨细胞增殖活性与对照组相比显示增高，有统计学意义（P＜0.05）。RT-PCR结果显示：60和80 μg/μL组BGP mRNA表达增强，有统计学意义（P＜0.01）。结论大豆异黄酮可以促进成骨细胞的增殖活性和BGP基因上调，并呈明显的剂量依赖关系。

大豆异黄酮；成骨细胞；骨钙素

随着老龄化时代的到来，绝经后骨质疏松症患病率逐年增高。雌激素治疗虽能减少绝经后妇女的骨丢失及骨折发生率[1]，但同时也增加了患乳腺癌和子宫内膜癌的风险[2，3]。近年来，植物雌激素以其在女性健康中的潜在作用而成为研究的热点，为防治绝经后骨质疏松提供了一条新思路。

大豆异黄酮类（isoflavones）主要是糖苷结合形式的染料木苷和黄豆苷，在体内细菌作用下，释放出具有生物活性的物质被吸收。近年研究表明，大豆异黄酮在动物试验和人群调查中对骨骼代谢、预防骨质疏松有重要作用，但在细胞水平，一直尚少有报道。本实验结合血清药理学方法采用体外细胞培养，目的在于从胞内信号转导水平探索成骨细胞骨钙素（BGP）的基因表达变化，研究大豆异黄酮防治骨质疏松症的作用机制。

1 材料与方法

1.1 试剂

低糖DMEM培养液、HEPES、胎牛血清（联星生物有限公司）、MTT（南京建成生物有限公司）。RNA试剂盒（美国GIBCO），逆转录酶为Roche公司。大豆异黄酮购自天津市康宁生物化学工程有限公司，总含量为50.27%。

1.2 原代成骨细胞的培养

将新生SD大鼠（中国医科大学实验动物中心）放入75%酒精中浸泡消毒15 min，无菌操作下取出颅盖骨。除去附着的血管及结缔组织，用PBS溶液清洗3次。剪成l mm×l mm大小的碎块。加入0.25%胰蛋白酶，于37 ℃消化30 min，弃去消化液，PBS溶液清洗干净后，加入0.02%Ⅱ型胶原酶，于37 ℃消化5次，每次20 min，弃除前两次消化液，取最后3次消化液，1000 r，离心10 min。弃上清液，所得白色沉淀物即为制得的成骨细胞样细胞团。用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养液重悬细胞至2×104/mL的细胞悬液，吹打均匀后。接种到100 mL培养瓶。置入37 ℃，含5% CO2饱和湿度的培养箱内进行培养，24 h换液。弃去悬浮细胞.每隔2 d换液1次。

1.3 细胞增殖MTT测定方法

取培养至第3代的成骨细胞以1×105个/mL密度接种于96孔培养板，每孔300 μL，24 h细胞贴壁后，弃培养液，分别加入含有大豆异黄酮（20、40、60、80 μg/μL）浓度培养液，另设加DMEM培养液作为阴性对照，每组8孔。继续培养48 h后，每组分别收集50 μL上清液。每孔加入MTT溶液20 μL，37 ℃孵育4 h，终止培养，小心吸弃上清；每孔加入DMSO溶液150 μL，振荡10 min，立即测定吸光度值（波长490 nm）。比较各组OD值的大小。

图1 大豆异黄酮对成骨细胞增殖活性测定

1.4 大豆异黄酮对成骨细胞BGP基因表达的影响

1.4.1 细胞总RNA提取

培养细胞经消化后，弃消化液，PBS洗涤2次；加入TRIZOL细胞裂解液。刮下细胞，连同裂解液一起转移至新的1.5 mL，Ep管中，室温放置5 min。加氯仿0.2 mL，剧烈震荡振荡15 s，室温静置3 min，4 ℃离心，12000 r，15 min，小心吸取上层水相，移至另一1.5 mL Ep管中。加等体积异丙醇，室温放置10 min，4 ℃离心，12000 r，10 min。弃上清，加预冷75%乙醇1 mL，旋涡振荡充分洗涤总RNA沉淀，4 ℃离心，12000 r，5 min。弃上清，快速离心5 s，将管底残余乙醇用移液器小心吸去，室温下晾干沉淀20 min。加20 μL无RNA酶水，溶解总RNA沉淀，用分光光度计测定其在260、280 nm处OD值，以确定核酸的纯度及浓度，并按照公式[mRNA]（μg/μL）=OD260×40×稀释倍数/1000。

1.4.2 RT-PCR

取3μg总RNA用TaKaRa RNA PCR Kit（AMV）Ver试剂盒逆转录合成cDNA。再用9700型PCR扩增仪（PE公司）进行PCR。BGP引物利用primer3软件设计，BGP上游：5'-GCA GGA GGG CAA TAA GGT-3'；BGP下游：5'-CGT AGA TGC GTT TGT AGGC-3'。用于扩增BGP基因cDNA，片段大小为164 bp。扩增条件为94 ℃ 5 min，94 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，68 ℃ 20 s，共30个循环。β-actin引物序列，上游：5'-CAT CTC TTG CTC GAA GTC CA-3'；下游：5'-ATC ATG TTT GAG ACC TTC AACA-3'，扩增片段：300 bp。扩增条件为94 ℃ 5 min，94 ℃ 15 s，55 ℃30 s，68 ℃ 20 s，共30个循环。

1.4.3 PCR产物半定量分析

取5 µLPCR产物经1.5%琼脂糖凝胶（含0.5 μg/mL EB），120 V恒压，40 min，紫外透射仪上观察结果，凝胶分析软件对电泳谱带进行半定量分析，用任意单位（AU）表示凝胶谱带的面积×荧光强度值，BGP与β-actin的AU比值代表各自的mRNA相对表达水平。

1.5 统计学处理

2 结 果

2.1 不同浓度的大豆异黄酮对成骨细胞增殖活性MTT结果显示：随大豆异黄酮浓度的上升，成骨细胞增殖活性呈上升趋势。其中，60、80 μg/μL与对照组相比，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 大豆异黄酮对成骨细胞增殖活性测定

2.2 RT-PCR半定量结果显示

与对照组（0.5386±0.028）相比，20 μg/μL（0.5620±0.020）和40 μg/μL（0.6228±0.012）组BGP mRNA表达没有统计学意义（P＞ 0.05）；60 μg/μL（0.7813±0.010）和80 μg/μL（0.8121±0.013）组BGP mRNA表达增强，有统计学意义（P＜0.01）（图1，图2）。

图2 大豆异黄酮对成骨细胞BGP mRNA表达

3 讨 论

骨组织中存在的细胞主要有3种：骨细胞、成骨细胞、破骨细胞。其中成骨细胞是骨组织中最活跃的细胞。成骨细胞存在于骨的表面以及骨间隙的孔隙内。其主要功能是合成、分泌骨基质并促进基质矿化形成骨组织[4-6]。骨钙素是成骨细胞合成分泌的一种非胶原蛋白，是反映成骨细胞分化成熟的指标，能准确表示成骨细胞的活性。当骨形成和骨吸收耦联时，骨钙素的主要生理作用是反映骨转换的指标；当骨形成和骨吸收解耦联时，骨钙素是反映骨形成的特异指标；它能准确反映成骨细胞的成骨功能[7，8]。

大豆异黄酮是植物雌激素的一种，主要包括大豆苷原、染料木黄酮和黄豆黄素，它们的结构与雌激素相似。本实验通过不同浓度的大豆异黄酮对体外培养的成骨细胞的增殖活性和BGP基因表达影响，结果表明，大豆异黄酮可以增加细胞水平的成骨细胞的增殖活性，并随浓度的增大呈上升趋势。在基因水平上，大豆异黄酮可促进大鼠成骨细胞BGP基因的表达，亦表现出明显的剂量依赖关系。由此可以推测，大豆异黄酮对骨骼代谢、预防骨质疏松的作用，可能是促进成骨细胞的增殖活性和增加细胞中BGP基因表达而介导，并表现出明显的剂量依赖关系。细胞培养研究表明，大豆异黄酮对成骨细胞增殖、大鼠骨代谢有促进作用，但其机制仍需进一步研究。成骨细胞增殖、分化的过程是一个受多种因素调节的复杂过程，其可能受到多种因素的影响。

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Effect of Isoflavones on Cell Proliferation Activity and Gene Expression of BGP mRNA in Cultured Rat Osteoblasts

SONG Mei, WANG Shu-fang, HUANG Yong-kai, WANG Hong-mei
(Department of Nephrology, Inner Mongolia Armed Police Hospital, Hohhot 010010, China)

ObjectiveTo study the effect of different concentrations of isoflavones on gene expression of BGP mRNA and cell proliferation activity in cultured rat osteoblasts.MethodsNewborn rat calvarid osteoblastic cell were isolated and cultured. They were cultured in medium with various concentration isoflavones(20, 40, 60, 80 μg/μL), compared to control group. The proliferation activity by MTT method. The total RNA was extracted by TRIZOL and analyaed with semi-quantitative RT-PCR.ResultsCompared to control group, the cell proliferation activity of 60 and 80 μg/μLgroup was significantly promoted(P＜0.05), the cell BGP mRNA expression of 60 and 80 μg/μL group was significantly upregulated(P＜0.01).ConclusionThe isoflavones could increase cell proliferation activity and expression of BGP mRNA. The effect was similar to estrogen.

Isoflavones; Osteoblast; Bone morphogenetic protein

R318

B

1671-8194（2014）27-0071-02