昼夜节律对心力衰竭兔心肌细胞钙火花发生率及时空特性的影响

李海涛，吴明，马建林，林劲，张敬文，王裕岱，韩丽珍

（海南省人民医院心血管病临床诊疗中心1、病案室2，海南海口570311)

·论著·

昼夜节律对心力衰竭兔心肌细胞钙火花发生率及时空特性的影响

李海涛1，吴明1，马建林1，林劲1，张敬文1，王裕岱1，韩丽珍2

（海南省人民医院心血管病临床诊疗中心1、病案室2，海南海口570311)

目的 观察不同昼夜节律下心力衰竭兔心肌细胞自发性钙火花发生率、时空特性及对交感刺激的反应。方法家兔心衰模型采用主动脉返流加主动脉缩窄的制作，依据相隔12 h的昼夜节律将心衰动物分为静息组及活动组，并分别按时间点分离心肌细胞(每组24个细胞)，使用激光共聚焦扫描技术制作细胞悬浊液并进行观察，测量钙火花发生率、幅值、半高宽、半高时程、上升时间和半衰减时间的变化。结果静息组心肌细胞自发性钙火花发生率及钙火花幅值、半高宽、半高时程、上升时间和半衰减时间明显低于活动组(P＜0.05)；给予ISO灌流后，静息组心肌细胞钙火花发生率及时空特性参数明显高于活动组(P＜0.05)。结论昼夜节律可影响衰竭心肌细胞局部钙释放及交感反应性，其可能是夜间或静息状态下高发室性心律失常的机制之一。

钙火花；室性心律失常；昼夜节律；心力衰竭

生物在进化的过程中由于受到昼夜变化环境信号的影响产生了与昼夜同步的生命活动，从而更好地适应环境，这是一种生理现象。机体心血管系统的诸多生理指标(如血压、心率等)及心血管事件(如心律失常、心肌缺血等)均呈现出昼夜节律，这种节律与自主神经系统即交感与迷走神经对心血管生理活动的调控作用密切相关[1]。

临床研究证实心力衰竭在进展过程中会产生自主神经系统功能的紊乱，其中交感神经兴奋性增强而迷走神经张力相对减弱是心力衰竭时主要神经体液代偿方式之一，可以表现为自主神经调节昼夜节律功能异常，出现与此类节律相关的心电异常，如自发除极易感性增加、室颤阈值降低等，可促使心律失常特别是室性心律失常发生，在心源性猝死患者中表现更加明显[2]。

目前有关昼夜节律与心力衰竭心律失常研究还处于萌芽阶段，对其与心衰心律失常发生的重要机制即钙释放是否相关及其对心脏交感兴奋的影响目前尚无明确的结论。

1 材料与结果

1.1 实验动物及分组选取成年新西兰大耳白兔共40只，雌雄不拘，体重在2～3 kg之间，由武汉大学人民医院实验动物中心提供。家兔心衰模型采用主动脉返流加主动脉缩窄的方法制作。麻醉动物后将4F鞘管置入左侧颈总动脉，经鞘管向心脏方向送入测压导管，用力刺破主动脉瓣数次。如果主动脉脉搏压升高至少50%则认为主动脉返流成功。两周后开腹行腹主动脉缩窄术使腹主动脉直径缩小大约50%，后关腹。两个月后行超声检查，左心室收缩末期内径超过1.20 cm，左心室射血分数低于40%者视为心衰模型制作成功，共22只纳入本研究并随机分入静息组及活动组。

1.2 实验材料和仪器异丙肾上腺素(ISO，250 nmol/L)，纯度98.5%，购自Tocris公司；Fluo-4-AM购自日本同仁化学研究所；8通道加药系统(美国ALA公司)；Scientific 3111型二氧化碳培养箱(美国Forma公司)；TCS SP2 AOBS激光扫描共聚焦显微镜(德国Leica公司)

1.3 心肌细胞的分离家兔处死后取心脏逆行灌流，参照文献[3]并做改进，酶解法制备心室肌单个细胞，按照静息组与活动组(每组11只)时间相隔12 h分离细胞，每组选取24个细胞纳入研究，分离后在8～10 h内完成实验。

1.4 激光共聚焦显像将钙荧光探针Fluo-4-AM与心肌细胞充分混悬，低温离心3次，将细胞悬液室温下避光孵育约30 min，向激光共聚焦扫描显微镜的载物观察槽中充入细胞悬液，静置3 min等细胞贴壁，选取横纹清晰、形态完整、表面平整干净、呈杆状、两端钝圆、折光性强的心肌细胞进行观察。显微镜扫描参数为：目镜为60倍油镜，物镜为63倍，N.A值为1.48，扫描，X-T扫描的采样参数为2 ms/线，0.164 μm/像素。图片大小为512×1 024像素，即每张图片扫描时间约1 000 ms。钙火花的认定标准是局部荧光强度(F)的升高＞背景荧光强度(F0)的3 S.D。钙火花参数包括：幅值(Amplitude，Fpeak/F0)、半高宽(Full width at half maximum intensity，FWHM)、半高时程(Full duration at half maximum intensity，FDHM)、上升时间(Rising time，RT、半衰减时间(Time for decay to half-peak intensity，THR)。给药时间分别为5 min，本研究连续扫描20幅图片然后得出每幅图的平均钙火花数(火花数/秒/采样像素断层厚度)，即为钙火花的自发频率。

1.5 统计学方法应用SPSS17.0软件进行统计学分析，计量数据以均数±标准差(±s)表示，首先通过ANOVA检验进行两因素两水平析因设计方差分析，在不存在交互效应的前提下(检验水准0.05)，组间数据比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞自发性钙火花事件次数的测定活动组细胞自发性钙火花发生次数明显高于静息组(P＜0.05)。给予交感激动剂ISO后，两组细胞上述各值均较给药前明显增加(P＜0.05)，但静息组值明显高于活动组(P＜0.05)，见表1。

表1 两组细胞给药前后钙火花发生率比较±s，n=24)

表1 两组细胞给药前后钙火花发生率比较±s，n=24)

注：连续扫描20幅图片，每幅图的平均钙火花数(火花数/秒/采样像素断层厚度)，即为钙火花的发生率。

2.2 细胞钙火花空间参数的测定活动组细胞幅值、半高宽明显高于静息组(P＜0.05)。给予交感激动剂ISO后，两组细胞上述各值均较给药前明显增加(P＜0.05)，静息组值明显高于活动组(P＜0.05)，见表2。

表2 两组细胞给药前后钙火花空间参数的比较(±s，n=24)

表2 两组细胞给药前后钙火花空间参数的比较(±s，n=24)

注：与静息组比较，aP＜0.05。

2.3 细胞钙火花时间参数的测定活动组细胞半高时程、上升时间和半衰减时间明显高于静息组(P＜0.05)。给予交感激动剂ISO后，两组细胞上述各值均较给药前明显增加(P＜0.05)，静息组值明显高于活动组(P＜0.05)，见表3。

表3 两组细胞给药前后钙火花时间参数的比较(±s，ms，n=24)

表3 两组细胞给药前后钙火花时间参数的比较(±s，ms，n=24)

3 讨论

大量研究证实，心源性猝死的发生存在明显的昼夜节律。Framingham研究发现心源性猝死事件主要集中在上午7时至9时[4]。在植入心脏复律除颤器(ICD)的患者则中室性心律失常亦多发生于上午和下午两个阶段，心力衰竭患者的室性心律失常也体现出相似的时间集中趋势[5]。

基础研究亦证实了心力衰竭时自主神经对心脏电活动的调节能力明显减弱，易导致心律失常特别是异位局部兴奋灶兴奋性升高相关的心律失常的发生，自主神经张力的昼夜节律变化可能是该现象的重要潜在机制之一[6]。昼夜节律失调状态下，副交感神经张力逐渐降低，转为交感神经兴奋为主的过程中，心肌异位兴奋点的阈值降低，自律性随之增高，各类自发性除极的易感性增加，导致室颤阈值降低，促发频发室性早搏甚至恶性室性心律失常发生。

本研究发现静息组心力衰竭心肌细胞本身自发性钙火花的发生率、峰值、半高宽、半高时程、上升时间与半衰减时间等参数均低于活动组，提示在处于静息状态下时，心肌细胞自身的钙释放功能受到昼夜节律的影响处于储备状态，夜间心肌细胞收缩期胞质内的游离钙离子含量显著低于日间活动时，减少了肌浆网中游离钙离子的一次同步释放(即钙火花)的数量所致，而钙火花释放的时空参数也体现出释放的强度与速率明显低于活动时。给予交感兴奋后，钙火花事件发生率及其时空参数数值较活动组明显增加，提示在静息状态下，心肌细胞钙释放功能较活动时对于突发性交感兴奋的敏感性和反应性更高。由于钙火花与儿茶酚胺敏感性的Ryanodine受体的调控息息相关[7]，可以推测静息状态下心肌细胞对于自主神经调节的瞬时失衡更加敏感。这也与心力衰竭患者上午起床后，血中儿茶酚胺浓度一过性增高，恰与心源性猝死发生的高峰时间一致的现象相吻合。

因此，我们将昼夜节律对钙火花的发生率、峰值、半高宽、半高时程、上升时间与半衰减时间等参数的影响归因为心力衰竭长期的自主神经功能失调，从而进一步增加了静息状态下衰竭心肌细胞钙释放功能对交感兴奋的敏感性和反应性，继而加剧静息状态下突发交感兴奋相关心肌细胞内异常钙离子时空分布异常，引起整体心脏电活动的一过性不稳定，导致了衰竭心脏室性心律失常的发生。

心力衰竭相关的恶性室性心律失常仍是心衰患者心源性猝死的主要原因之一，关于其发生机制以及干预治疗也是目前亟待解决的难题。本研究表明昼夜节律可以直接影响衰竭心肌细胞钙释放功能，其机制可能是提高了心肌细胞对于交感兴奋反应的敏感性，进而影响心衰患者恶性室性心律失常的发生，该因素临床意义的确立将会为心衰心律失常的治疗提供全新的思路。

[1]Chatham JC,Young ME.Regulation of myocardial metabolism by the cardiomyocyte circadian clock[J].J Mol Cell Cardiol,2013,55: 139-146.

[2]Takeda N,Maemura K.Circadian clock and cardiovascular disease [J].J Cardiol,2011,57(3):249-256.

[3]Bassani JW,Bassani RA,Bers DM.Relaxation in rabbit and rat cardiac cells:species-dependent differences in cellular mechanisms[J]. J Physiol,1994,476(2):279-293.

[4]Noseworthy PA,Peloso GM,Hwang SJ,et al.QT interval and long-term mortality risk in the Framingham Heart Study[J].Ann Noninvasive Electrocardiol,2012,17(4):340-348.

[5]Kim SH,Nam GB,Baek S,et al.Circadian and seasonal variations of ventricular tachyarrhythmias in patients with early repolarization syndrome and Brugada syndrome:analysis of patients with implantable cardioverter defibrillator[J].J Cardiovasc Electrophysiol,2012,23(7):757-763.

[6]Schroder EA,Lefta M,Zhang X,et al.The cardiomyocyte molecular clock,regulation of Scn5a,and arrhythmia susceptibility[J].Am J Physiol Cell Physiol,2013,304(10):954-965.

[7]Aiba T,Tomaselli GF.Electrical remodeling in the failing heart[J]. Curr Opin Cardiol,2010,25(1):29-36.

Influence of circadian rhythms in the incidence and spatiotemporal properties of calcium spark in myocardial cells in rabbits with heart failure.

LI Hai-tao1,WU Ming1,MA Jian-lin1,LIN Jin1,ZHANG Jing-wen1,WANG Yu-dai1,HAN Li-zhen2.Center of Cardiovascular Disease1,Medical Records Office2,the People's Hospital of Hainan Province,Haikou 570311,Hainan,CHINA

ObjectiveTo observe the variation of the incidence and spatiotemporal properties of spontaneous calcium spark in myocardial cells of rabbits with heart failure and their response to β-Adrenergic stimulation with different circadian rhythms.MethodsRabbit models of heart failure were induced by combined aortic insufficiency and constriction,which were divided into resting group and active group according to circadian rhythms.Myocytes were isolated at 2 opposing time points(24 cells in each group).Cell suspension was prepared by confocal laser scanning and the observed.Incidence of calcium sparks and its spatiotemporal properties were evaluated by confocal scanning.ResultsIncidence rate,amplitude,full half-height width(FWDH),full duration at half maximum(FDHM), rising time(RT)and time to half-regression(THR)of spontaneous calcium spark in myocardial cells in resting group was markedly lower than that in active group(P＜0.05).Under β-Adrenergic stimulation,the incidence rate and properties of spontaneous calcium spark in myocardial cells in the resting group were significantly greater than that in the active group.ConclusionCircadian rhythms might influence the local calcium release and sympathetic reaction in failing heart cells,which could be a mechanism of high-incident ventricular arrhythmias at night or resting state.

Calcium spark;Ventricular arrhythmia;Circadian rhythm;Heart failure

R-332

A

1003—6350（2014）21—3121—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.21.1226

2014-03-25)

国家自然科学基金（编号：81260052)；海南省自然科学基金（编号：812147)；海南省卫生厅自然科学基金（编号：琼卫2011-11)

李海涛。E-mail:mdlht@hotmail.com