改良激素法建立早期股骨头坏死动物模型①

闵红巍，刘克敏，王安庆，韩新祚，顾蕊

股骨头坏死(osteonecrosis of the femoral head,ONFH)高发于30～50岁人群，治疗困难且致残率高，是临床骨科急待解决的重大课题。激素性ONFH是非创伤性ONFH的主要原因之一，确切的发病机制尚不明确，其病变晚期不可逆。目前，ONFH研究的一个重点是早期诊断，希望通过中西药物、体外震波、自体骨髓干细胞移植等方法使早期的ONFH逆转，有极大的临床价值。而研究早期诊断的主要方法是建立早期的ONFH的动物模型。本实验通过改良激素法有效地复制出接近临床的早期ONFH动物模型，适用于ONFH发病机制及早期诊断等方面的研究。

1 材料和方法

1.1 动物及分组

健康雄性比格犬20只，由首都医科大学动物中心提供，体重(6.0±0.5)kg，适应性饲养1周后编号，用随机数字表法将其分为实验组和对照组，每组各10只。饲养温度(22±3)℃，湿度(50±20)%，分笼在相同条件下喂养。

1.2 动物模型的制备

实验组肌注脂多糖(美国SIGMA公司)10 μg/kg，然后连续3 d肌注甲基泼尼松龙(美国普强药厂产品)20 mg/kg；对照组肌注等量生理盐水。

1.3 观察内容及方法

1.3.1 一般行为学观察 连续4个月对各组比格犬进行一般状态的观察，包括精神状态、毛色、姿势、体重等。

1.3.2 血液学检查 两组动物注射药物前和注射药物后24 h抽静脉全血2 ml进行凝血功能测定(ACL200全自动血凝分析仪，美国贝克曼-库儿特公司)，包括血浆凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血酶时间(APTT)、抗凝血酶-Ⅲ(AT-Ⅲ)。

1.3.3 MRI检查 全部犬在注射药物后2个月、4个月分别行股骨头轴位、冠状位扫描。扫描采用1.5 T超导型磁共振机(Philips)。速眠新(长春军事医学科学院军事兽医研究所)0.2 ml/kg肌肉注射麻醉后，将比格犬仰卧位置于髋关节线圈内，髋关节及膝关节弯曲成适当角度后固定于线圈上，采用SE序列T1WI(TR/TE=358/18 ms)、 T2WI(TR/TE=1015/1000 ms)进 行 扫 描 ，层厚4 mm，间隔4 mm，FOV 210，矩阵256×256，扫描范围130 mm。MRI均由两位放射诊断科医师阅片，观察有无软骨及软骨下骨质形态和信号改变。

1.3.4 组织形态学观察 注射药物后2个月、4个月，两组各处死5只动物。速眠新麻醉效果满意后，取髋关节后外侧切口，逐层切开组织显露髋关节，显露出股骨上端，用电锯行股骨上端截骨，取下股骨头，大体标本观察包括股骨头外形改变和关节软骨面的改变。

标本沿冠状面切开后置于10%福尔马林溶液中固定2周，10%硝酸脱钙1周，冲水过夜后，按常规方法沿股骨头冠状面切片，层厚1.0 μm，进行HE染色。由两位病理科医师于显微镜(Olympus)下观察股骨头区骨髓水肿情况、血管改变(压迹、血栓等)、髓腔造血细胞和脂肪细胞的数量变化、坏死情况，骨细胞坏死情况、空陷窝数、骨小梁数量和周围成骨情况，以及软骨面塌陷和软骨下骨板情况。

1.4 统计学分析

采用SPSS 13.0统计软件对用药前后两组动物的凝血参数进行配对t检验。显著性水平α=0.05。

2 结果

2.1 一般形态观察结果

动物形态：两组动物形态未见明显改变，无消瘦、腹胀、四肢变细等，实验期间无动物出现死亡。

股骨外形：股骨头形态正常，软骨面光滑，无塌陷，切面肉眼观察未见明确的坏死灶。

2.2 镜下结构

对照组10只动物的20个股骨头在用药后2个月、4个月时，可见软骨细胞排列整齐，软骨下血管丰富，骨小梁整齐清晰，排列规则，骨小梁中的骨细胞清晰可见，周围成骨细胞丰富，空陷窝少见，髓腔内造血细胞丰富，形态正常。见图1。

实验组用药后2个月，5只动物有4髋出现ONFH，表现为脂肪细胞肥大，髓腔造血细胞减少，骨小梁变细，间距增大，结构紊乱，部分有断裂现象，骨小梁内骨细胞核固缩，胞核小，空陷窝数增多。骨髓表现为片状坏死。见图2。

实验组用药后4个月，5只动物有6髋出现ONFH，表现为骨髓造血细胞极少，充满脂肪细胞，骨小梁中断，空陷窝增多，坏死骨小梁周围可见少量成骨细胞，坏死灶可见炎细胞和少量新生血管，部分坏死灶周围见纤维血管组织修复。见图3。

2.3 影像学表现

对照组应用药物后2个月和4个月，10只犬的20个股骨头形态正常，T1WI表现为高信号，T2WI表现为低或中等信号，MRI未见异常信号改变。见图4。实验组应用药物后2个月和4个月后，10只犬的20个股骨头形态正常，MRI未见异常信号改变。见图4。

图1 对照组正常病理图(HE染色)

图2 实验组用药2个月后(HE染色)

图3 实验组用药4个月后(HE染色)

图4 两组MRI(股骨头形态均正常，未见异常信号)

2.4 血液学指标检测结果

用药前，两组间PT、APTT、AT-Ⅲ均无显著性差异(P＞0.05)。注射后，实验组PT、APTT、AT-Ⅲ均显著缩短(P＜0.001)，且显著短于对照组(P＜0.001)。见表1～表3。

表1 两组用药前后PT比较(s)

表2 两组用药前后APPT比较(s)

表3 两组用药前后AT-Ⅲ比较(s)

3 讨论

ONFH是一种常见的致残率较高的骨科疾病。1957年，Pietrogrand等首次报道糖皮质激素易引起ONFH，但到目前为止人们还没完全弄清楚其发病机制[1]。因此，建立理想的成人ONFH的动物模型，是研究成人ONFH病因及发病机制十分重要的手段，也是进行治疗的基础。目前ONFH的造模方法主要有：创伤法(损伤股骨颈骨膜、髋关节脱位并且切断圆韧带[2-4])；物理法(如液氮冷冻[5]、微波[6]等)；化学法(股骨头内注射乙醇[7])；非创伤法(激素、内毒素或血管内皮细胞生长因子受体抗体诱导[8-12])。实验动物大多为四足动物和两足动物。前者主要包括鼠、兔、犬、猪、绵羊、山羊及马，后者包括鸡、鹅、鸸鹋。

长期使用或短期内间断大量使用糖皮质激素可引起ONFH，已为临床和实验研究证实，人和动物对皮质激素的反应是一致的[13]。但激素应用剂量、时间与骨坏死产生的关系仍不确切；同样应用激素治疗，而ONFH的发生率及病变范围却有差异。曾有人认为在健康的动物单纯应用激素可能不引起骨坏死，但从目前的文献报道来看，这种推测比较武断。也有学者认为并不是单纯激素不能导致骨坏死，而是激素应用的剂量、次数、应用方式(冲击或持续应用)以及动物个体对激素的耐受性不同。

临床上，肾病综合征、感染性休克、妊娠并发症、恶性肿瘤、系统性红斑狼疮等是应用激素较多且较易出现ONFH的疾病，而这些疾病有一个共同特点，即在使用激素前就已经存在前凝血状况。因此，利用施瓦兹曼反应(Schwartzman reaction)首先造成动物的前凝血状况，继而使用大剂量激素造成ONFH模型是符合临床要求的。由于利用施瓦兹曼反应处理的动物死亡率较高，因此在本实验中，我们采用改良施瓦兹曼反应，在大动物体内单次注射大肠杆菌内毒素联合应用甲基泼尼松龙，用药后2个月和4个月，病理结果显示有4髋和6髋发生ONFH，并且无一例动物死亡。说明改良施瓦兹曼反应可以引起ONFH，且死亡率低。

虽然目前ONFH研究已达到分子及基因水平，但其确切的发病机制仍不十分清楚。1992年，Jones正式提出非创伤性骨坏死血管内凝血学说，并在随后的研究中不断加以完善。越来越多的研究表明ONFH的发生与凝血功能异常有关[14-16]。本研究结果显示，应用内毒素和激素后，血浆PT、APTT、AT-Ⅲ明显降低，表明血液处于高凝低纤溶状态。由于血栓前状态的存在，形成骨内微血栓，从而引起一系列的病理变化。血栓形成后，一方面可损害动脉灌注，并且更为严重地损害静脉引流，导致骨内间隔综合征，使骨内静脉压升高，灌注减少，进而加重了股骨头的缺血并导致骨坏死。另一方面，被激活的凝血瀑布反应可诱发组织的炎性反应，加剧局部病变。

虽然说成人ONFH的病因及发病机制尚不完全清楚，但对其病理过程已有较清楚的认识。一般认为，无论什么原因引起成人ONFH，其病理改变都是相似的[17]，即先有细胞坏死，随后通过血管再生，新骨形成和死骨(小梁)吸收进行修复。由于骨组织对缺血持续的时间、缺血的范围、缺血的程度以及骨组织对缺血反应能力和状态的不同，其病理变化的进程也有所不同；ONFH的病理改变主要是脂肪及水含量的变化，因此MRI诊断骨坏死具有很强的特异性和敏感性。尽管如此，还必须认识到。MRI信号改变仍然是骨坏死病理变化进展到相当程度的影像表现。因此，若MRI正常，也不能完全排除ONFH[18]。相信随着磁共振技术的发展，其在ONFH诊断中的应用会越来越广泛。

在本研究中，实验组用药后2个月4髋发生ONFH，其病理变化表现为脂肪细胞肥大，骨小梁变细，部分有断裂现象，骨小梁内骨细胞核固缩，胞核小，空陷窝数增多。未见明显修复反应，表明骨坏死处于早期阶段。实验组用药后4个月有6髋发生ONFH，其病理变化表现为骨小梁中断，空陷窝增多，坏死骨小梁周围可见少量成骨细胞，坏死灶可见浆细胞和少量新生血管，部分坏死灶周围见纤维血管组织修复。实验组用药后2个月和4个月MRI未见异常信号，这可能是因为坏死尚处于早期阶段，同时坏死的范围较小、修复反应比较局限。

本研究也存在着一些不足。一方面研究的样本量相对较少，进行统计分析时说服力较弱；另一方面实验组观察的时间点较少，不利于动态观察早期ONFH的病理和影像学变化。此外，四足动物造模的最大限制在于其不能正常负重。因为动物在患肢疼痛情况下常采取保护性肢体回缩，这与人髋关节负重模式有很大的不同。这也是本模型难以造成股骨头晚期塌陷的原因之一。

总之，改良激素法可建立早期ONFH模型，其具有创伤小、造模方法简单、成模时间短、动物死亡率低、其病理特点贴近人ONFH病理演变规律等优点，是一种比较理想的造模方式。

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