针药并用对子宫内膜异位症大鼠血管内皮生长因子的影响

张春雁,张晓云,李连波,朱俊,周殷,陈云飞



针药并用对子宫内膜异位症大鼠血管内皮生长因子的影响

张春雁1,张晓云2,李连波1,朱俊1,周殷1,陈云飞1

(1.上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院,上海 200437;2.上海中医药大学附属龙华医院,上海 200030)

观察针药配合对子宫内膜异位症(endometriosis,EMs)大鼠血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达的影响,探讨针药配合治疗子宫内膜异位症的作用机制。建立大鼠EMs模型,随机分为模型组、针灸组、中药组、针药组,并设立假手术组。针灸组电针血海、三阴交,艾灸关元;中药组采用加味没竭片生理盐水混悬液灌胃;针药组采用上述两种方法综合治疗;假手术组和模型组捆绑固定并行生理盐水灌胃。治疗30 d后,取腹腔灌洗液及血清ELISA法检测VEGF水平,测量异位囊肿最大直径,取异位组织进行组织病理学观察,免疫组化法测定组织中VEGF的蛋白水平。针药组异位囊肿最大直径明显小于模型组、针灸组及中药组(＜0.01);模型组异位内膜生长旺盛,针药组内膜趋于萎缩,部分上皮细胞坏死;模型组腹腔灌洗液和异位组织中VEGF的表达显著高于其他各组,针药组腹腔灌洗液VEGF表达显著低于模型组、中药组、针灸组(＜0.01),针药组异位组织中VEGF表达强度低于模型组(＜0.01)和中药组(＜0.05)。大鼠EMs发病与其病变局部及腹腔微环境中VEGF水平相关,针药配合能缩小EMs大鼠子宫内膜囊肿大小,下调异位组织及腹腔液中异常升高的VEGF蛋白表达。

针药并用;大鼠;子宫内膜异位症;血管内皮生长因子

子宫内膜异位症(endometriosis,EMs)是指具有生长功能的子宫内膜组织出现在子宫腔被覆黏膜以外的身体其他部位。临床上以痛经、不孕和月经失调作为其主要症状,严重影响患者的生活质量。该病多发生在30～45岁女性,发病率呈逐年上升趋势。目前,EMs的临床诊治指南,主要是针对疼痛、包块和不孕的手术、药物及助孕技术等治疗对策[1]。但该病难以根治,术后3年复发率高达38%～51%[2],且上述疗法均存在缺陷[3]。因此,弄清EMs可能的发病机制,探索有效的、副反应少、复发率低的治疗手段,是当前妇科学亟待解决的问题之一。中医学在EMs的治疗上具有独特的优势,针灸和中药作为两大治疗手段,在该病的治疗上已取得了满意的疗效[4-6]。

对于EMs发病机制的认识,目前较为公认的是Sampson等[7]于1922年提出的子宫内膜种植学说,认为EMs的发病存在异位内膜种植侵袭、新生血管形成等重要过程。我们前期研究证实[8],大鼠EMs的发病与异位组织中异常升高的基质金属蛋白酶-2 (matrix metalloproteinase-2,MMP-2)有关,针药结合可能通过下调内异症大鼠异位组织中异常升高的MMP-2表达水平,达到缩小异位囊肿、治疗大鼠内异症的效应。但是随着逆流经血侵袭局部基质并种植在腹腔或其他部位的异位内膜,其生长还需要形成自身的血管网以获取营养物质,异位病灶周围的血管化程度是影响异位内膜生长力和侵袭力的重要因素之一。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是一种结合肝素的二聚体糖蛋白,它直接作用于血管内皮细胞,是迄今为止发现的最为重要的血管生长因子。VEGF在EMs发病中究竟扮演怎样的角色?

本研究在前期工作基础上,采用针灸配合中药加味没竭片作用于EMs大鼠模型,对大鼠EMs可能的发病机制以及针药配合治疗大鼠EMs的效应及其可能的机理,从血管生成角度进行了深入的研究。

1 材料与方法

1.1 实验动物

由上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院实验动物中心[SYXK(沪)2011-0109]提供,上海市斯莱克实验动物有限责任公司[SCXK(沪)2012-0002]生产,清洁级雌性成熟未交配SD大鼠50只,体重(200±20)g,给予标准光照周期(14 h光照、10 h黑夜),室内温度(20±2)℃,湿度(50±10)%,标准饲料。

1.2 器械、药品

毫针(中研太和牌,0.22 mm×25 mm)、艾炷(绿莹牌,6.5 mm×15 mm)、加味没竭片(沪药制字Z05050329, 0.3 g/片,120片/瓶)。

1.3 仪器设备

G6805-1A型治疗仪(上海华谊医用仪器厂)、Model 680酶标仪(美国BIO-RAD公司)、OLYMPUS-BX43型显微照相系统(奥林巴斯光学工业株式会社)等。

1.4 试剂

抗大鼠VEGF单克隆抗体(珠海市泉晖企业有限公司,RTU-VEGF-qh,Batch:130410201)、GTVisionTMⅢ抗鼠/兔通用型免疫组化检测试剂盒[Gene Tech (shanghai)Company Limited Code No GK500705]、Rat VEGF Immunoassay(R&D Systems Cat No RRV00,检测血清中VEGF含量)、大鼠VEGF酶联免疫试剂盒(武汉新启迪生物科技有限公司Cat No EIA05906,检测腹腔灌洗液中VEGF含量)。

1.5 实验方法

1.5.1 分组与模型制作

将50只大鼠随机分为假手术组10只和造模组40只,阴道脱落细胞涂片动态监测大鼠动情周期,在动情期,造模组参照Jones法[9]进行手术造模,假手术组进行假手术,开腹方法同造模组,找到左侧子宫,用血管钳夹持牵拉子宫角,分层关闭腹腔。常规饲养21 d后,开腹探查,见异位囊肿形成,取部分异位囊肿行组织病理学检查,验证EMs大鼠模型建立成功。将造模组随机分为模型组10只、针灸组10只、中药组10只、针药组10只。

1.5.2 治疗及对照处理

假手术组和模型组进行捆绑固定和生理盐水灌胃,针灸组进行捆绑针灸和生理盐水灌胃,中药组进行捆绑固定和加味没竭片生理盐水混悬液灌胃,针药组采用捆绑针灸和加味没竭片生理盐水混悬液灌胃。

1.5.2.1 针灸

捆绑固定后,选取单侧血海、三阴交和关元3穴(大鼠穴位定位参照文献[10])。以毫针刺入血海与三阴交,接G6805治疗仪,采用连续波,电流强度0.3～0.6 mA,每日单侧1次,次日换另一侧穴位,双侧交替治疗;关元穴处贴置6.5 mm×15 mm的艾炷,点燃施灸,每次2壮,每日1次。

1.5.2.2 灌胃

生理盐水灌胃参照《动物实验方法学》[11],根据大鼠体重,按照10 mL/kg计算灌胃量。加味没竭片生理盐水混悬液灌胃参照《动物实验方法学》[11],根据成人药物剂量换算大鼠等效剂量为3.74 mg/kg,并根据大鼠体重,按照10 mL/kg计算灌胃量,每次灌胃前将配制好的混悬液颠倒混匀。

1.5.2.3 疗程

每日1次,30 d为1个疗程,共治疗1个疗程。

1.5.3 取材与指标检测

疗程结束后,阴道脱落细胞涂片动态监测动情周期,在动情期对大鼠进行取材及相应指标检测。

1.5.3.1 腹腔灌洗液VEGF表达水平检测

按Nagelschmidt等[12]报道的方法,先将3 mL 0.15 mol/L PBS Buffer自左侧腹部注入腹腔,将腹部轻微振荡2 min后,用注射器自腹腔将灌洗液抽出,离心并收集上清液。采用ELISA法检测,按照相应的试剂盒说明书进行操作。

1.5.3.2 血清VEGF表达水平检测

开腹取各组大鼠外周血,离心取血清。采用ELISA法检测,按照相应的试剂盒说明书进行操作。

1.5.3.3 异位囊肿大小测量

大鼠开腹后,找到异位囊肿,用游标卡尺测量并记录最大直径。

1.5.3.4 组织VEGF表达水平检测

取子宫组织、异位内膜组织置于10%中性缓冲福尔马林溶液中固定,脱水,石蜡包埋,3mm连续切片,采用免疫组织化学法检测组织片中VEGF含量。VEGF主要表达于子宫内膜间质细胞及血管内皮细胞的细胞浆中,以间质细胞或血管内皮细胞胞浆呈棕黄色为阳性。免疫组化阳性判定方法参照Donnez等[13]的报道并予以改进,采用盲法,3名研究者(病理医生)分别完成,任取连续5个高倍(×400)视野计数阳性细胞百分比,取平均值,判定该组织片VEGF表达阳性强度。设定3个评分等级,阳性细胞数≤25%为弱阳性,阳性细胞数26%～50%为阳性,阳性细胞数＞50%为强阳性。

1.5.4 统计学方法

各组异位囊肿最大直径,血清及腹腔灌洗液中VEGF水平比较,采用方差分析;各组组织中VEGF阳性强度比较,采用卡方检验或’确切概率法。采用SPSS16.0,以≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 各组异位囊肿大小比较

假手术组未见异位囊肿,模型组异位囊肿最大直径[(4.950±0.268)mm]显著大于其他各组(＜0.01),针药组[(1.760±0.317)mm]显著小于模型组、针灸组[(3.290±0.166)mm]和中药组[(3.480±0.148)mm] (＜0.01)。异位囊肿大小可直接指示内异症的治疗情况,本研究采用异位囊肿最大直径衡量其大小,结果提示针灸、中药和针药配合对大鼠EMs有一定的治疗效应,其中针药配合效果优于单纯针灸或中药。详见图1。

2.2 在位内膜和异位内膜组织病理学观察

假手术组子宫内膜上皮细胞排列整齐,呈柱状或立方状,胞浆丰富,间质丰厚,间质细胞多,可见腺腔,腺上皮细胞呈柱状或立方状,内膜腺体弯曲扩张;模型组异位内膜上皮细胞呈高柱状,腺体弯曲扩张或无腺体,间质致密,血管丰富;针灸组和中药组异位内膜上皮细胞排列杂乱或略整齐,呈柱状或立方状,间质疏松,间质细胞较少,无腺体,血管较少;针药组异位内膜趋于萎缩,上皮细胞排列稀疏,部分细胞坏死,间质疏松,间质细胞较少,无腺体,血管较少。

图1 各组大鼠异位囊肿最大直径比较(Mean±2SD)

2.3 组织中VEGF蛋白表达

VEGF在子宫内膜组织中主要表达于子宫内膜间质血管内皮细胞胞浆。免疫组化结果显示,假手术组子宫内膜组织中VEGF表达呈弱阳性;模型组异位内膜组织镜下可见大量毛细血管,血管内皮细胞VEGF表达呈强阳性。异位内膜组织中VEGF蛋白表达,模型组20%(2/10)呈阳性、80%(8/10)呈强阳性,针灸组60%(6/10)呈弱阳性、40%(4/10)呈阳性,中药组50%(5/10)呈弱阳性、50%(5/10)呈阳性,针药组100%(10/10)呈弱阳性。模型组异位内膜组织VEGF阳性强度高于其余各组(＜0.01);针药组与针灸组比较异位内膜组织VEGF阳性强度无统计学差异(=0.087),针药组异位内膜组织VEGF阳性强度低于中药组(=0.033)。详见表1、图2,箭头处为阳性表达细胞。

表1 大鼠子宫内膜与异位内膜组织中VEGF蛋白表达的比较 [n(%)]

注:与模型组比较1)＜0.01,与中药组比较2)＜0.05

2.4 腹腔灌洗液中VEGF蛋白水平

模型组大鼠腹腔灌洗液中VEGF含量[(6.314±0.212)ng/mL]明显高于其他各组(＜0.01),针药组[(6.444±0.279)ng/mL]明显低于模型组、针灸组[(8.425±0.146)ng/mL]和中药组[(8.259± 0.243)ng/mL](＜0.01)。结果提示EMs大鼠腹腔灌洗液中VEGF浓度异常升高,针灸、中药和针药配合均可下调EMs大鼠腹腔灌洗液中异常升高的VEGF浓度,其中针药结合效果优于单纯应用针灸或中药。详见表2。

2.5 血清中VEGF蛋白水平

采用ELISA法测定各组大鼠血清中VEGF含量,结果测定的浓度值为负值,无法统计比较。分析可能由于大鼠血清中的VEGF浓度较低,EMs大鼠血清中VEGF的含量并未升高。

表2 各组大鼠腹腔灌洗液VEGF含量比较 (±s,ng/mL)

注:与假手术组比较1)＜0.01;与模型组比较2)＜0.01;与针灸组比较3)＜0.01;与中药组比较4)＜0.01

图2 大鼠子宫内膜与异位内膜组织VEGF表达(IHC×400)

3 讨论

中医学将子宫内膜异位症归为“痛经”、“癥瘕”、“月经不调”、“不孕”的范畴,病因病机多责之于血瘀,在治疗上取得了一定的成效。针灸和中药是中医学的传统治疗手段,多年来广泛应用于对本病的治疗中。临床资料显示,针灸对EMs的疗效明显,目前多采用针刺[14]、温通药灸[15]、穴位敷贴[16]、针灸并用[17]、穴位注射加隔药饼灸[18]、针药并用[5]等治疗方法,临床多选用血海、三阴交等为主穴,血海为足太阴脾经腧穴,具有调经统血的作用,是治疗妇科疾病的要穴;三阴交为足三阴经交会穴,可以调气活血,疏经止痛,而本病的发病与肝、脾、肾三脏密切相关,故乃治疗主穴;关元系足三阴、阳明、任脉、冲脉之会,任冲二脉皆起于胞宫,任脉为“阴脉之海”,冲脉为“血海”,该穴又位于脐下三寸,邻近胞宫,故亦为治疗EMs之要穴。上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院朱氏妇科长期运用“加味没竭片”治疗EMs,具有活血化瘀,破气行滞,消积定痛的功效,积累了大量的临床经验[19]。但是针灸与中药治疗EMs其效应机制尚未阐明,且临床研究多局限于针灸或中药单一的治疗方法,较少将两者结合进行研究。

异位囊肿形成是大鼠EMs的主要表现,异位囊肿的大小直接指示EMs的病理状态,对于疗效的判定,亦是比较客观的证据[20]。本研究选取异位囊肿最大直径的测量结果对治疗效应进行评判,结果证实,经针药配合治疗的EMs大鼠,其异位囊肿最大直径较模型组、针灸组、中药组明显减小,提示针药配合可有效减小异位囊肿大小,且该作用优于单纯应用针灸或中药。通过组织病理学观察亦证实针药结合具有延缓EMs异位组织细胞生长,促进异位组织萎缩的效应。

在EMs的形成与发展中,VEGF的含量增高,在自分泌和旁分泌的共同作用下,刺激毛细血管增生,为异位生长的腺上皮细胞提供赖以生存的物质基础,促进异位内膜增殖和浸润入盆腔和腹腔内组织,形成盆腔和腹腔的异位灶[21-22]。有研究显示[23],VEGFs和NRPs等生长因子及其受体表达的失调可能导致EMs血管生成、淋巴管生成、神经与免疫功能的改变。EMs组织中血管内皮生长因子C表达增加,可增强内皮功能,增加血管通透性,促进血管生成和异位组织生长[24]。朱虹等[25]研究显示,盆腔外EMs、卵巢EMs的异位内膜中存在VEGF的高表达,可能导致了血管生成,利于种植及生长,可能成为EMs早期诊断的指标。动物实验发现[26],在人子宫内膜间质细胞与裸小鼠的腹膜间皮细胞黏附的第1天,小鼠子宫内膜间质细胞已有VEGF mRNA的表达。这说明子宫内膜间质细胞分泌的VEGF很可能是异位病灶中最早的促血管生成因子。

本研究选取VEGF从新生血管形成的组织发生机理角度,分别从组织本身和腹腔微环境,评估异位内膜组织血管形成作用。结果证实,假手术大鼠在位内膜中血管较少,间质细胞或血管内皮细胞VEGF呈弱阳性表达,腹腔灌洗液中VEGF含量较低;EMs模型大鼠异位内膜组织中血管较为丰富,间质细胞或血管内皮细胞中VEGF呈强阳性表达,有大量新生血管,腹腔灌洗液中VEGF含量异常升高,这就促进了异位组织的血供,有利于异位组织的进一步生长,这与张旭宾等[27]研究报道一致。而针灸组、中药组和针药组异位内膜组织VEGF呈弱阳性或阳性表达,腹腔灌洗液中VEGF含量较低,尤其是针药组含量趋近于假手术组,且异位内膜组织中VEGF表达强度低于中药组,提示针药结合对EMs大鼠异位内膜组织血管形成具有较好的抑制作用,使得提供异位组织生长的营养物质相对减少,考虑这也是导致针药组异位囊肿缩小、异位内膜组织萎缩的可能原因。

本研究结合VEGF在EMs发病中的作用,及针药结合治疗大鼠EMs的疗效观察,分析针药配合发挥疗效可能是通过下调异位内膜组织及腹腔微环境中VEGF蛋白的表达,从而削弱异位内膜血管形成作用,减少局部的营养供应,进而达到治疗大鼠EMs的效应。推测下调异位内膜组织和腹腔微环境中VEGF蛋白的表达是针药配合治疗大鼠EMs的可能机制之一。对于针药结合对异位组织中VEGF蛋白表达的调节作用,目前尚未见相关报道。但VEGF促进血管形成的始动因素是什么,如何更有效地控制血管形成,减少异位组织血供,将异位组织扼杀?这些均有待于进一步研究探索。

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Effect of Combined Acupuncture and Medicine on the Expression of Vascular Endothelial Growth Factor in Endometriosis Rats

-1,-2,-1,1,1,-1.

1.,,200437,; 2.,200030,

To investigate the effect of acupuncture combined with Jiawei Mojie Pian on the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) in endometriosis (EMs) rats and explore the mechanism of action of combined acupuncture and Chinese herbal medicine in treating endometriosis.A rat model of EMs was made. The rats were were randomly allocated to model, acupuncture, Chinese herbal medicine and acupuncture plus medicine groups. A sham operation group was set up. The acupuncture group received electroacupuncture at Xuehai (SP10) and Sanyinjiao (SP6) and moxibustion on Guanyuan (CV4); the Chinese herbal medicine group, an oral gavage of a suspension of Jiawei Mojie Pian in normal saline; the acupuncture plus medicine group, a combined treatment with the above two methods. The sham operation and model groups were bound and fixed, and given an oral gavage of normal saline.The peritoneal lavage fluid and serum were taken after 30 days of treatment. VEGF levels were measured by ELISA. The maximum diameter of ectopic cyst was determined. The ectopic tissue was taken for histopathological observation. The protein level of tissue VEGF was measured by immunohistochemical method.The maximum diameter of ectopic cyst was significantly shorter in the acupuncture plus medicine group than in the model, acupuncture and Chinese herbal medicine groups (＜0.01). Ectopic endometrium grew vigorously in the model group. The endometrium tended to atrophy and part of the epithelial cells became necrosis in the acupuncture plus medicine group. The expression of VEGF in the peritoneal lavage fluid and ectopic tissue was significantly higher in the model group than in the other groups. The expression of VEGF in the peritoneal lavage fluid was significantly lower in the acupuncture plus medicine group than in the model, Chinese herbal medicine and acupuncture groups (＜0.01). The expression of VEGF in the ectopic tissue was significantly lower in the acupuncture plus medicine group than in the model and Chinese herbal medicine groups (＜0.01 and＜0.05, respectively).The occurrence of EMs in rats is related to VEGF levels in the lesion and abdominal cavity microenvironment. Combined acupuncture and medicine can reduce the size of ectopic endometrium tissue and down-regulate the abnormally increased expression of VEGF protein in the ectopic tissue and peritoneal fluid in EMs rats.

Combined use of acupuncture and medicine; Rats; Endometriosis; Vascular endothelial growth factor

1005-0957(2014)08-0764-05

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2014.08.0764

2014-03-20

上海市自然科学基金项目(13ZR1442800);上海市卫生局中医药科研基金项目(2012QL006A)

张春雁(1981 - ),女,主治医师,上海中医药大学2011级博士生

陈云飞(1968 - ),男,研究员,Email:icyf1968@163.com