电针百会、足三里穴对睡眠剥夺大鼠学习记忆的影响

张继红,范卫



电针百会、足三里穴对睡眠剥夺大鼠学习记忆的影响

张继红,范卫

(复旦大学附属金山医院,上海 201508)

观察电针百会、足三里穴对睡眠剥夺(SD)后大鼠学习记忆能力的影响以及脑干中多巴胺(DA)和5-羟色胺(5-HT)含量的变化。将32只雄性SD大鼠随机分为正常组、睡眠剥夺组、假针组和电针组。采用Morris水迷宫实验和避暗实验分别在连续5 d的睡眠剥夺前后测试大鼠的学习记忆能力,并应用高效液相色谱(HPLC)和电化学检测器检测大鼠脑干中DA和5-HT含量。在Morris水迷宫实验中,睡眠剥夺组和假针组的潜伏期均高于正常组和电针组(＜0.05);睡眠剥夺组和假针组的平台象限滞留时间均低于正常组和电针组(＜0.05),电针组低于正常组(＜0.05)。在避暗实验中,连续5 d的睡眠剥夺后睡眠剥夺组、假针组和电针组的步入潜伏期均低于正常组(＜0.05),而电针组高于睡眠剥夺组和假针组(＜0.05)。连续5 d的睡眠剥夺后,睡眠剥夺组和假针组大鼠脑干DA含量均低于正常组和电针组(＜0.05),电针组低于正常组(＜0.05);睡眠剥夺组和假针组大鼠脑干5-HT含量均高于正常组和电针组(＜0.05),电针组高于正常组(＜0.05)。电针可明显改善睡眠剥夺后大鼠的学习记忆能力,其机制可能与脑干中DA和5-HT含量的变化有关。

针刺疗法;电针;睡眠剥夺;多巴胺;5-羟色胺;大鼠;学习记忆

睡眠是机体进行自我修复的重要过程,生命大约三分之一的时间是在睡眠中度过的。随着社会和科技的发展,当前人们的生活节奏越来越快,“熬夜”逐渐成为各年龄层的生活习惯,而且睡眠时间和睡眠规律也呈现紊乱,这将会影响整个机体的机能。早期的研究已经证实一定时间的睡眠剥夺可导致记忆力下降[1],因此由睡眠问题导致的记忆障碍逐渐引起人们的关注。从延髓至中脑的脑干中,存在着调节睡眠与觉醒的脑中枢。1949年意大利著名电生理学家马鲁吉和马贡发现,电刺激脑干网状结构可引起动物的觉醒反应。此后大量实验研究表明,无论是各种外部刺激还是感觉通路的电刺激,均沿传入通路的侧支引起脑干网状结构的兴奋,然后再引起大脑皮层广泛区域的觉醒反应。因此,把脑干上部的网状结构称为上行网状激活系统, 上行网状激活系统正常活动可维持大脑皮质的清醒状态。

针刺是中医学特色的治疗方法,通过针刺腧穴达到调节脏腑,引畅气血的功能。百会穴为百脉之会,贯达全身,是调节大脑功能的要穴,常与足三里、三阴交等穴配合,具有醒脑开窍、安神定志等功能[2]。足三里穴为足阳明胃经的要穴之一,具有调理脾胃、补中益气、通经活络等功能,在神经系统主要促进脑细胞机能恢复。笔者通过电针百会、足三里穴观察其对睡眠剥夺大鼠学习记忆的影响,现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物和分组

清洁级SD大鼠32只,雄性,体质量为(250±20) g,上海斯莱克实验动物有限责任公司提供。饲养于12 h光照/12 h黑暗的环境中,室温控制在(22±1)℃,自由摄食和饮水,在实验环境中适应1星期后进行正式实验。对动物的处理均符合国际实验动物使用准则。动物分为正常组、睡眠剥夺组、假针组和电针组,每组8只,其中睡眠剥夺组给予连续5 d(120 h)的睡眠剥夺;电针组在连续5 d的睡眠剥夺过程中每日给予30 min电针百会穴和足三里穴;假针组在连续5 d的睡眠剥夺过程中每天在百会穴和足三里穴位旁皮下给予针刺但不通电,且保持大鼠不睡眠;正常组不给予任何干预。

1.2 动物模型的制备

采用小平台水环境法[3]。根据文献自制30 cm×30 cm×40 cm的鼠箱,其中有一直径为6.3 cm、高8 cm的平台,在平台周围注满水,水温保持在20℃,水面距平台面约1.0 cm。睡眠剥夺的大鼠在小平台上屈曲而立 ,在快动眼睡眠时,由于伴随全身肌肉松弛和节律性垂头,大鼠落入水中而惊醒,再爬上平台。每日换水并清洗鼠箱。在大鼠活动空间给予12 h/12 h明暗交替,室内温度控制在18～22℃。实验前,让大鼠熟悉适应环境1星期,然后放入装置进行连续5 d的睡眠剥夺。

1.3 电针方法

参照《实验针灸学》选取百会穴和足三里穴,使用韩氏电针仪(LH-202 型),频率为2 Hz,电流强度为1 mA,以大鼠头部微颤为宜,持续30 min。电针于大鼠开始睡眠剥夺的第1天开始,每天上午9时开始给予30 min的电针并监控大鼠不能睡觉,连续给予电针5 d。

1.4 避暗实验

先将大鼠放入明室,明/暗两室之间的门洞敞开,让动物在两室内自由活动2～3 min,取出后放回饲养笼。第2天,将大鼠放入明室,当它进入暗室后将其关闭在暗室中接受0.8 mA的足底电击而不能逃避。24 h后再次将大鼠放入明室,进行测试记录动物进入暗室的潜伏期,为步入潜伏期[4]。

1.5 Morris水迷宫测试

Morris水迷宫测试分为两个阶段。①定位航行试验,即试验连续进行4 d,每天大鼠连续测试4次,分别从1、2、3、4这4个象限入水,入水时动物面向池壁,记录其从入水开始至找到平台这段时间内大鼠的轨迹和时间。②空间探索试验,即第5天撤走平台,任选1个入水点将大鼠面向池壁放入水中,游泳时间均为60 s,记录大鼠在平台所在象限滞留时间和找到平台的潜伏期,以此作为空间记忆力的成绩。

1.6 脑干DA和5-HT的含量测定

睡眠剥夺及行为学测试结束后即刻处死大鼠,立即取脑冰上分离脑干,液氮速冻后移入-80℃保存。采用高效液相色谱和电化学检测器检测脑干DA和5-HT的含量。测定时将脑干称重后加入9倍体积的甲醇,冰浴下匀浆,离心后取上清测定。色谱条件分为,固定相为AQ-C18色谱柱;流动相为乙腈/水=7/93,流速0.5 mL/min,进样量10mL。

1.7 统计学方法

采用SPSS11.0统计软件对数据进行统计分析,计量资料以均数±标准差表示,采用单因素方差分析(),以＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 睡眠剥夺后大鼠一般状况和行为变化

睡眠剥夺5 d后大鼠的一般状况表现为疲惫不堪、皮毛蓬乱、无光泽,尾巴和爪子有损伤。睡眠剥夺5 d行为变化尤其明显,表现为大鼠兴奋性提高,探究行为和攻击性增强,对环境刺激的警觉性、反应性及进攻行为也增强。

2.2 大鼠学习记忆测定

2.2.1 4组大鼠睡眠剥夺前后避暗实验步入潜伏期比较

表1 4组大鼠睡眠剥夺前后避暗实验步入潜伏期比较 (±s,s)

注:与正常组比较1)＜0.05;与睡眠剥夺组比较2)＜0.05;与假针组比较3)＜0.05

睡眠剥夺前各组大鼠步入潜伏期比较,差异均无统计学意义(＞0.05)。在连续5 d的睡眠剥夺后,大鼠避暗实验的步入潜伏期发生变化。睡眠剥夺组、假针组、电针组大鼠睡眠剥夺后避暗实验步入潜伏期与正常组比较,差异均具有统计学意义(＜0.05)。假针组、电针组睡眠剥夺后避暗实验步入潜伏期与睡眠剥夺组比较,差异均具有统计学意义(＜0.05)。电针组睡眠剥夺后避暗实验步入潜伏期与假针组比较,差异具有统计学意义(＜0.05)。

2.2.2 4组大鼠睡眠剥夺前后Morris水迷宫测试比较

Morris水迷宫测试主要观察大鼠放入迷宫到第1次找到平台位置的潜伏期和60 s测试时间内滞留在平台所在象限的滞留时间。由表2可见,4组大鼠睡眠剥夺前Morris水迷宫测试潜伏期比较,差异均无统计学意义(＞0.05)。睡眠剥夺组和假针组大鼠睡眠剥夺后Morris水迷宫测试潜伏期与正常组和电针组比较,差异均具有统计学意义(＜0.05)。

表2 4组大鼠睡眠剥夺前后Morris水迷宫测试潜伏期比较 (±s,s)

注:与正常组比较1)＜0.05;与假针组比较2)＜0.05

由表3可见,4组睡眠剥夺前Morris水迷宫测试平台象限滞留时间比较,差异均无统计学意义(＞0.05)。睡眠剥夺组、假针组、电针组睡眠剥夺后Morris水迷宫测试平台象限滞留时间与正常组比较,差异均有统计学意义(＜0.05)。电针组大鼠睡眠剥夺后Morris水迷宫测试平台象限滞留时间与睡眠剥夺组和假针组比较,差异均具有统计学意义(＜0.05)。

表3 4组大鼠睡眠剥夺前后Morris水迷宫测试平台象限滞留时间比较 (±s,s)

注:与正常组比较1)＜0.05;与睡眠剥夺组比较2)＜0.05;与假针组比较3)＜0.05

2.3 4组大鼠睡眠剥夺后脑干DA和5-HT含量比较

表4 4组大鼠睡眠剥夺后脑干DA和5-HT含量比较 (±s,ng/mg)

注:与正常组比较1)＜0.05;与睡眠剥夺组比较2)＜0.05;与假针组比较3)＜0.05

由表4可见,睡眠剥夺组、假针组、电针组大鼠睡眠剥夺后脑干DA和5-HT含量与正常组比较,差异均具有统计学意义(＜0.05)。电针组大鼠睡眠剥夺后脑干DA和5-HT含量与睡眠剥夺组和假针组比较,差异均具有统计学意义(＜0.05)。

3 讨论

睡眠剥夺是由于某些原因导致的睡眠数量被迫减少而产生的一种特殊的心理生理状态。长期睡眠障碍可导致脑功能紊乱,表现为学习记忆能力减退和其他复杂的神经生理与生化改变[5]。睡眠剥夺是研究睡眠的重要方法,采用小平台水环境法制作大鼠睡眠剥夺模型,应用此法时大鼠尚能进行慢波睡眠,因此剥夺的主要是快波睡眠(异相睡眠),其对学习和记忆的影响更大[6]。本研究采用避暗实验和Morris水迷宫实验两种方法观测大鼠在连续5 d睡眠剥夺的情况下其学习记忆能力的变化,结果与大多数文献报道的相一致,均出现学习记忆能力的下降。

目前关于睡眠剥夺导致学习记忆受损的机制研究主要集中于睡眠剥夺可导致脑内神经递质系统紊乱、诱导异常基因的表达以及引起脑内神经网络功能平衡失调等方面。其中睡眠剥夺所致脑内神经递质系统紊乱失衡是非常重要的一个原因。中枢神经系统的5-HT神经元,主要分布在脑干中缝附近的狭窄区域内——中缝核及其附近网状结核内,是脑内合成5-HT的主要部位。中缝向上的纤维叫做5-羟色胺能上行通路,与下丘脑、边缘系统以及大脑皮层发生联系,参与维持醒觉、睡眠、情绪等活动有关。研究发现,在睡眠剥夺前期,机体能通过增加单胺氧化酶活性加快 5-HT 转化为5-羟吲哚乙酸,以减少 5-HT 在脑内的积累,达到维持清醒的目的。但随着睡眠剥夺时间的延长,单胺氧化酶的活性降低,转化作用减弱5-HT 在脑干、下丘脑等蓄积,机体产生更加严重的疲劳感。此外,长时间睡眠剥夺后,突触前膜 5-HT 受体敏感性下降,对 5-HT 的再摄取减少,同时 5-HT 合成增加,机体内 5-HT 水平增高,出现疲劳感和睡意[7-8]。在本实验中,经过120 h睡眠剥夺的大鼠脑干中 5-HT 含量显著升高,可能是由于单胺氧化酶的活性低,导致 5-HT 的集聚。

DA作为中枢的神经递质之一,主要负责兴奋的传递,也与上瘾有关。人脑中多巴胺能神经元总数约为40万,广泛投射到端脑、间脑、脑干和脊髓,其中中脑的多巴胺能神经元投射到脑干和脊髓形成下丘脊髓束,可参与调节脑干网状系统的状态。DA对神经系统有兴奋作用,随着睡眠剥夺的进行,中枢疲劳的出现,中枢中 DA 含量逐渐减少。近来的一些研究证实,多巴胺可以与去甲肾上腺素受体相互作用后,抑制中枢的去甲肾上腺素,尤其是脑干网状结构中的去甲肾上腺素系统[9-10]。其他研究表明,被剥夺快眼睡眠的动物前额皮质中 DA 含量下降而NE 水平升高。本研究中,睡眠剥夺后的各组大鼠脑干中 DA 下降,可能是其认知功能下降的重要因素。研究表明睡眠剥夺后,精神认知行为会出现一定的抑制趋势,这可能与5-HT在下丘脑和脑干的过度堆积有关,大鼠的行为兴奋性又与DA释放呈正相关[11]。因此,我们推测在睡眠剥夺后大鼠的精神认知行为表现可能受5-HT和DA这一对神经递质在脑内尤其是在下丘脑和脑干中的平衡相关,这也是我们以脑干中5-HT和DA浓度变化评价电针作用效果的原因。

本结果显示,电针大鼠的百会穴和足三里穴后,可改善睡眠剥夺后大鼠在避暗测试和水迷宫测试中的学习记忆能力,提示电针百会穴和足三里穴所产生的开窍醒脑、健脑益智的作用在睡眠剥夺状态中也可显现。

传统中医文献中未见到直接对睡眠剥夺的记载,但多认为其与“虚劳”、“郁证”相类似,多因积劳内伤等引起的阴阳失调、气血失和。现代医学有研究认为电针可调节中枢神经系统的功能,包括神经递质系统的平衡[12-13]。从本研究的结果可以看出经电针干预后睡眠剥夺大鼠的脑干5-HT有所下降而DA浓度有所升高(相对于睡眠剥夺组和假针组),从而使由睡眠剥夺引起的5-HT和DA浓度变化趋向于正常水平,但是电针如何调节脑干中5-HT和DA浓度变化,以及如何使得睡眠剥夺后大鼠学习记忆能力的改善仍是我们下一步研究的重点。

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Effect of Electroacupuncture at Baihui and Zusanli on Learning and Memory in Rats with Sleep Deprivation

-,.

,201508,

o investigate the effect of electroacupuncture at baihui and Zusanli on learning and memory, and changes in the dopamin (DA) and 5-hydroxytryptamine (5-HT) contents of the brainstem in rats with sleep deprivation (SD).Thirty-two male SD rats were randomly allocated to normal, sleep deprivation, sham acupuncture and electroacupuncture groups. Rat learning and memory abilities were tested using the Morris water maze and the dark avoidance test before and after five consecutive days of sleep deprivation. The DA and 5-HT contents of rat brainstem were measured by high performance liquid chromatography (HPLC) and electrochemical detection.In Morris water maze experiment, the latency was longer and time spent in the platform quadrant was shorter in the sleep deprivation and sham acupuncture groups than in the normal and electroacupuncture groups (both＜0.05). Time spent in the platform quadrant was shorter in the electroacupuncture group than in the normal group (＜0.05). In the dark avoidance test, step-through latency was shorter in the sleep deprivation, sham acupuncture and electroacupuncture groups than in the normal group (＜0.05) and longer in the electroacupuncture group than in the sleep deprivation and sham acupuncture groups (＜0.05) after five consecutive days of sleep deprivation. After five consecutive days of sleep deprivation, the DA content of rat brainstem was lower in the sleep deprivation and sham acupuncture groups than in the normal and electroacupuncture groups (＜0.05) and lower in the electroacupuncture group than in the normal group (＜0.05); the 5-HT content of rat brainstem was higher in the sleep deprivation and sham acupuncture groups than in the normal and electroacupuncture groups (＜0.05) and higher in the electroacupuncture group than in the normal group (＜0.05).Electroacupuncture can markedly improve learning and memory in rats with sleep deprivation. The mechanism may involve changes in the DA and 5-HT contents of the brainstem..

Acupuncture therapy; Electroacupuncture; Sleep deprivation; Dopamine; 5-hydroxytryptamine; Rats; Learning and memory

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2014.07.0676

1005-0957(2014)07-0676-04

张继红(1976 - ),女,主管技师

范卫(1968 - ),女,副研究员,E-mail:weifan117@aliyun.com

2014-02-17