电针对骶上脊髓损伤后神经源性膀胱大鼠膀胱最大容量和组织形态的影响

匡静之，张 泓*，艾 坤，张雨辰，鲍秋影，李景兴

（湖南中医药大学针灸推拿学院，湖南 长沙 410208）

电针对骶上脊髓损伤后神经源性膀胱大鼠膀胱最大容量和组织形态的影响

匡静之，张 泓*，艾 坤，张雨辰，鲍秋影，李景兴

（湖南中医药大学针灸推拿学院，湖南 长沙 410208）

目的 通过观察电针对骶上脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）后神经源性膀胱大鼠的膀胱最大容量、组织形态学的影响，了解电针治疗骶上SCI后神经源性膀胱的部分机制。方法 制作骶上SCI后神经源性膀胱大鼠模型，电针大鼠“次髎”、“中极”、“三阴交”三穴，采用尿流动力学、HE染色观察电针对骶上SCI后神经源性膀胱大鼠的膀胱最大容量、膀胱组织形态的影响。结果 膀胱最大容量检测结果显示：造模后第14天即治疗前1天模型组、针刺穴位组、针刺对照点组之间差异无统计学意义（P＞0.05）；治疗7 d后，针刺穴位组、针刺对照点组高于模型组，差异有显著统计学意义（P＜0.01）；针刺穴位组、针刺对照点组治疗前后比较，差异无统计学意义（P>0.05），模型组与7 d前比较，差异有显著统计学意义（P<0.01）。说明造模后大鼠膀胱最大容量呈下降趋势，电针治疗可明显改善膀胱最大容量使其趋于稳定。HE染色结果显示：电针可减轻膀胱组织形态病理损害程度，且针刺穴位组效果优于针刺对照点组。结论 电针骶上SCI后神经源性膀胱大鼠“次髎”、“中极”、“三阴交”三穴可明显改善膀胱最大容量的稳定性，减轻膀胱组织病理损害程度，从而抑制膀胱逼尿肌亢进，恢复膀胱功能。

电针；骶上脊髓损伤；神经源性膀胱大鼠；膀胱最大容量；组织形态

骶上脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）后引起的神经源性膀胱(Neurogenic bladder，NB)临床上多以膀胱储尿功能下降、尿急、尿频为主要表现，严重时可能导致急迫性尿失禁，严重影响患者的生存质量和生命安全。有大量研究认为，骶上SCI后引起的逼尿肌反射亢进是由于破坏了能对骶髓排尿中枢产生抑制作用的神经中枢或传导纤维，形成了新的骶髓反射弧[1-4]。已有研究[5]证实电针治疗有促进损伤脊髓修复的作用，本文通过观察电针对骶上SCI后神经源性膀胱大鼠的膀胱最大容量、膀胱组织形态的影响，以了解电针治疗骶上SCI后神经源性膀胱的部分机制。现将实验方法及结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物和分组 40只雌性SD大鼠，体质量250～280 g，由湖南中医药大学实验动物中心提供，动物合格证号:SCXK<湘>2011-0003。常规饲养20 d后编号，随机取10只作为空白组，其余30只大鼠进行骶上脊髓损伤的手术造模，14 d后确定神经源性膀胱模型成功后再用随机数字表法分为3组:模型组、针刺穴位组、针刺对照点组，每组10只。

1.1.2 主要仪器 SDZ-V型华佗牌电针治疗仪（苏州医疗用品厂有限公司）；3F输尿管导管（上海上医康鸽医用器材有限公司）；820型薄片切片机 （美国AO公司）；XS-200型双目显微镜（江南光学集团）；Bx-70显微成像系统 （日本Olympus公司）；IPP6.0图像分析系统（美国MEDIA CYBERNETICS）。

1.2 模型制备

除空白组外，其余3组参照Hassan Shaker[6]脊髓横断法并加以改良，制作骶上脊髓损伤模型。具体操作方法如下:大鼠禁食不禁水12 h后进行手术，术前2 h腹腔注射青霉素钠20万U以抗炎。用10%水合氯醛按30 mg/kg进行腹腔注射麻醉，将大鼠以俯卧位固定于鼠板上，以其浮肋连接第13胸椎作为骨性标志来定位，脊髓损伤节段统一定在第10胸椎下，确定部位后备皮、消毒，沿背部正中线以T10-11为中心做长约2～3 cm的纵向切口，向两侧分离皮肤及皮下组织，暴露T10、T11棘突以及与之相邻的椎弓。用显微咬骨器从尾侧向头侧咬除T10椎板至两侧椎弓根，直至脊髓暴露。然后用牙科弯钩将椎间隙中的脊髓勾出，手术刀尖快速切断，可反复几次以确保脊髓完全横断。术后观察大鼠的心跳和呼吸无异常后，分层缝合肌肉、皮肤。术中用消毒纱布压迫止血，术后络合碘消毒伤口并皮下注射乳酸钠林格液2 mL以防止术后电解质紊乱。以双下肢瘫痪作为 SCI造模成功的标志。大鼠术后均置于37℃恒温电热毯上单笼饲养，每天腹腔注射20万U青霉素钠进行抗感染处理，连续7 d。脊髓休克期膀胱处于尿潴留状态每天手法辅助排尿2～3次，术后第12～14天大鼠均度过脊髓休克期，膀胱出现无抑制性收缩，膀胱最大容量明显下降，说明骶上SCI后神经源性膀胱模型造模成功，第15天开始治疗。

1.3 治疗方法

空白组不做任何处理，模型组只捆绑不针刺，针刺穴位组和针刺对照点组选取直径0.3 mm×25 mm的毫针进行针刺，针刺穴位组选取 “次髎”、“中极”、“三阴交”三穴，针刺对照点组选取上述三穴的对照点，根据李忠仁主编[7]《实验针灸学》及华兴邦等[8]制定的《实验动物穴位图谱》提供的方法，并模拟人体腧穴骨度分寸法量取。具体定位及操作如下:“次髎”[9]（第2骶后孔处），直刺15 mm；“中极”（神阙穴[10]与耻骨联合上缘连线的上 4/5与下 1/5的交点），直刺5 mm；“三阴交”（后肢内踝尖直上方1 cm处），直刺5 mm；“次髎对照点”（次髎外侧旁开0.3 cm处取穴），直刺15 mm；“中极对照点”（中极左侧旁开0.3 cm处取穴），直刺5 mm；“三阴交对照点”（三阴交向后旁开0.3 cm处取穴），直刺5 mm。针刺后接用SDZ-V型华佗牌电针治疗仪（苏州医疗用品厂有限公司），中极与三阴交为一组（三阴交左右两穴隔日交替进行），左右两次髎穴为一组。电针刺激参数:疏密波，密波频率50 Hz，疏波频率10 Hz，密波工作9 s，疏波工作5 s，强度以肢体轻颤并耐受为度。治疗时间20 min，每隔24 h治疗1次，共7次。

1.4 观察指标、样本采集及检测方法

1.4.1 大鼠一般情况观察 反应、进食、活动、爬行、膀胱充盈度及是否需要手法辅助排尿。

1.4.2 膀胱最大容量观察 将大鼠仰卧位固定，碘伏消毒大鼠尿道外口及肛门。两根导管置入前均灭菌处理，然后用无菌生理盐水充盈并排出导管中的气体，先将一根F3输尿管导管用石蜡油润滑后从大鼠尿道外口缓缓置入尿道和膀胱，深约 4.0～ 5.0 cm，其后将另一根F3输尿管导管润滑后从前一根的后方缓缓导入尿道和膀胱，深度同前，最后用胶布将两根导管固定，分别作为灌注管（红色）和溢出管（黑色）。用手法辅助排尿的方法将大鼠膀胱中的残余尿量从导管中完全排出后，用1 mL的注射器抽取无菌生理盐水缓缓从灌注管（红色）推入，速度为0.01 mL/s，密切观察另一根平放于鼠板的溢出管（黑色），直到有液体溢出时停止灌注，记录推入的生理盐水容量总和即为膀胱的最大功能容量。

1.4.3 组织形态观察 7次治疗后，4组大鼠进行1次膀胱最大容量的观察并记录，然后以10%水合氯醛腹腔注射麻醉。在全麻状态下迅速剖腹，取出膀胱组织用冰生理盐水冲洗后放入4%的多聚甲醛溶液中固定24～48 h，行HE染色，做显微观察。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 一般情况观察

造模前，各组大鼠均反应灵活、活动自如、有自主排尿能力。实验期间，空白组大鼠如前，模型组、针刺穴位组、针刺对照点组大鼠造模术后分为两个时期:（1）脊髓休克期:3组大鼠后肢没有参与行走，只在前肢行走时处于拖动状态，膀胱胀大明显，出现尿潴留，每天需手法辅助排尿2次。（2）脊髓休克期过后:大鼠后肢仍不能参与行走，膀胱胀大不明显，无需手法辅助排尿，下腹部及笼内垫料潮湿。且经治疗后针刺穴位组和针刺对照点组与模型组比较，膀胱较充盈。

术后并发症主要有伤口和肺部及泌尿系感染、血尿、褥疮、自残。正式实验过程中，感染和血尿出现4例，自残出现2例，褥疮出现3例，整个实验结束时3组大鼠的存活情况:模型组7只，针刺穴位组8只，针刺对照点组7只。

2.2 膀胱最大容量的观察

膀胱最大容量检测结果显示:造模后第14天即治疗前1天模型组、针刺穴位组、针刺对照点组之间差异无统计学意义（P＞0.05）；治疗7 d后，针刺穴位组、针刺对照点组高于模型组，差异有显著统计学意义（P＜0.01）；针刺穴位组、针刺对照点组治疗前后比较，差异无统计学意义（P>0.05），模型组与7 d前比较，差异有显著统计学意义（P<0.01）。上述结果表明造模后大鼠膀胱最大容量呈下降趋势，电针治疗可明显缓解其下降趋势，使膀胱最大容量趋于稳定。结果见表1。

表1 各组大鼠治疗前后膀胱最大容量的比较 （mL，±s）

表1 各组大鼠治疗前后膀胱最大容量的比较 （mL，±s）

注:与空白组比较▲▲P＜0.01；与模型组比较◆◆P＜0.01;与同组治疗前比较★★P＜0.01。

组别空白组模型组针刺穴位组针刺对照点组n 10 7 8 7治疗前0.920±0.079 3.185±0.567▲▲2.887±0.473▲▲2.851±0.629▲▲治疗后0.930±0.067 1.686±0.363▲▲★★2.750±0.363▲▲◆◆2.729±0.515▲▲◆◆

2.3 膀胱组织形态的观察

通过光学显微镜观察各组大鼠膀胱的组织形态学可见:（1）空白组:可见移形上皮细胞整齐排列，固有膜完整，无炎性及水肿改变。逼尿肌细胞形态大小均一，肌纤维有序排列，肌束之间结构紧密，结缔组织充满间隙（图1-A）。（2）模型组:逼尿肌纤维的数量和层次显著高于空白组，同时肌纤维肥大，上皮的层次和数量也增多，固有层及黏膜层附近有出血，部分细胞结构被破坏，部分肌层及浆膜下层可见散在的表面颗粒状的肥大细胞（图1-B）。（3）针刺穴位组:逼尿肌纤维的数量和层次轻度增高，上皮层次和数量轻度增多，固有层及黏膜层附近少量出血，少数细胞结构被破坏，肌层及浆膜下层可见少数颗粒状的肥大细胞（图1-C）。（4）针刺对照点组:逼尿肌纤维的数量和层次轻度增高，上皮层次和数量轻度增多，固有层及黏膜层附近少量出血，少数细胞结构被破坏，肌层及浆膜下层可见少数颗粒状的肥大细胞（图1-D）。

图1 各组膀胱组织形态学的光镜图（HE×400）

3 讨论

脊髓是控制尿道外括约肌和逼尿肌功能活动的初级排尿中枢，也是连接高级排尿中枢的神经纤维与膀胱尿道，并将两者间的感觉冲动相互传导的共同通道。骶上SCI后，脑桥排尿中枢与下级排尿中枢之间的联系中断或部分损伤，而骶髓排尿中枢保持了完整并失去了上级排尿中枢的控制，排尿反射从长程的脊上调节变成节段性反射，逼尿肌自发地产生兴奋，出现无抑制性收缩。

本实验通过对治疗前后各组大鼠膀胱最大容量的检测发现，大鼠骶上脊髓损伤并度过脊髓休克期以后，膀胱逼尿肌会出现无抑制性收缩、膀胱最大容量呈逐渐减小趋势，并随着损伤后时间的延长，膀胱最大容量会逐渐降低，如模型组7 d后较7 d前比较膀胱最大容量明显降低（P＜0.01），而经电针治疗的针刺穴位组和针刺对照点组大鼠膀胱最大容量基本趋于稳定，无明显减小趋势，治疗前后比较无明显差异（P＞0.05），提示电针可有效地减轻膀胱逼尿肌的无抑制性收缩，增加膀胱的顺应性，使膀胱功能得到一定程度的恢复。

本实验HE染色结果显示，与空白组相比，模型组中逼尿肌纤维的数量、层次、形态均发生病理改变，此外还兼有出血、炎性病变、细胞结构破坏等病理改变。而针刺穴位组和针刺对照点组膀胱组织的病理改变程度较模型组明显减轻，这可能是电针刺激了膀胱逼尿肌纤维和细胞，使得膀胱逼尿肌组织在受到非致死性伤害后发生改变和适应的能力恢复正常，从而减轻了大鼠膀胱逼尿肌的组织形态学损害。此外，针刺穴位组略优于对照点组，说明针刺次髎、中极、三阴交三穴促进损伤后膀胱组织形态学的修复具有穴位特异性。其中，“次髎”穴为足太阳膀胱经腧穴，位于骶部，既是局部取穴，又是治疗膀胱病的经验效穴，针刺次髎有调理膀胱经气，促进膀胱与肾对尿液的气化固摄；“中极”穴为膀胱的募穴，是膀胱经气汇聚之处，可助膀胱气化，调节膀胱功能，善治膀胱约束无权之尿失禁；“三阴交”穴是肝脾肾三条阴经的交会穴，而肝经、脾经、肾经均循行经过小腹，且脾经主运化水湿、肝经主疏泄、肾经主二便，故刺激能达到调理肝、脾、肾之经气，促进肾与膀胱对尿液的气化固摄[11]，起到调节膀胱功能的作用。

电针对骶髓损伤后神经源性膀胱的疗效已得到临床和实验的肯定，本实验结果从电针次髎、中极、三阴交三穴可改善膀胱最大容量、减轻膀胱组织形态的病理改变，部分阐述了其对神经源性膀胱的可能保护机制，从而达到调节膀胱功能、指导临床中电针治疗神经源性膀胱应用的作用。

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（本文编辑 杨 瑛）

Effects of electroacupuncture on maximum bladder capacit and histomorphology in rats with neurogenic bladder after sacral spinal cord injury

KUANG Jingzhi,ZHANG Hong,AI Kun,ZHANG Yuchen,BAO Qiuying,LI Jingχing
(College of Acupuncture and Massage,Hunan University of CM,Changsha,Hunan 410208,China)

Objective To understand the mechanisms of electroacupuncture on neurogenic bladder by investigating the effects of electroacupuncture on maximum capacit and histomorphology in rats after sacral spinal cord injury(SCI).Methods Rat model with neurogenic bladder was produced by SCI,and model rats were treated by electroacupuncture at “Ciliao”,“Zhongji”,“Sanyinjiao”three points.The urodynamics was used to test the effects of electroacupuncture on the maximum capacity ofthe bladder.HE staining was used to observe the effects of electroacupuncture on the bladder histomorphology.Results 14 days after modeled,there were no differences in bladder capacity among model group,electroacupuncture at acupoint group and electroacupuncture control group.7 days after treatment,bladder capacity in electroacupuncture at acupoint group and electroacupuncture control group were higher than that of model group(P<0.01); there were no differences in electroacupuncture at acupoint group and electroacupun cture control group before and after treatment (P>0.05); there were marked differencesin model group before and after treatment(P<0.01).Bladder capacity was decreased after modeled, and electroacupuncture can improve the maximum bladder capacity and make it stable.Moreover, electroacupuncture alleviated pathological damage of bladder,and the effects of electroacupuncture acupoint group was better than that of electroacupuncture control group.Conclusion The effects of Electroacupuncture at rats “Ciliao”, “Zhongji”, “Sanyinjiao”three acupoints on neurogenic bladder after SCI can obviously improve the stability of maximum bladder capacity,reduce bladder tissue pathological damage,thereby inhibiting bladder detrusor hyperreflexia,recovering bladder function.

Electroacupuncture;sacral spinal cord injury;neurogenic bladder;maximum bladder capacity;histomorphology

R245.97；R651.2；R694.5

B

10.3969/j.issn.1674－070X.2014.01.014.047.04

2013－09－11

湖南省自然科学基金项目（13JJ3098）；湖南省中医药科研计划项目（201109）；湖南省教育厅科研项目（12C0264）。

匡静之，女，硕士，主要从事针灸治病机制的研究。

*张 泓，男，教授，博士研究生导师，E-mail:zh538127@sina.com。