郭伟 冯江敏 孙立等
[摘要] 目的 观察促红细胞生成素(EPO)对慢性马兜铃酸肾病(CAAN)大鼠血管性假血友病因子(vWF)表达的影响,探讨促红细胞生成素对慢性马兜铃酸肾病大鼠的肾脏保护作用。方法 雌性Wistar大鼠30只,随机分三组:①CAAN模型组,②EPO治疗组,③正常对照组,每组各10只,关木通水煎剂灌胃12周制备CAAN大鼠模型。从第13周起,治疗组大鼠给予皮下注射重组人EPO每次50 IU/kg,每周3次,共6周。第19周检测各组大鼠血尿素氮(BUN)、血肌酐(SCr)、尿蛋白、血红蛋白(Hb)、血vWF水平;免疫组化法检测肾组织vWF的表达。结果 与CAAN组比较,EPO治疗组BUN、SCr、尿蛋白水平、vWF水平下降,Hb水平升高 (均P<0.05)。同时EPO治疗组大鼠肾组织vWF的表达减少(P<0.05)。 结论 EPO治疗可以改善CAAN大鼠的肾功能,可能与其下调vWF,减轻内皮损伤有关。
[关键词] 促红细胞生成素;马兜铃酸;慢性;大鼠;血管性假血友病因子
[中图分类号] R692 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701(2014)12-0008-03
[Abstract] Objective To observe the effect of erythropoietin on the expression of Von Willebrand factor(vWF) in CAAN rats and to investigate the protective effect of erythropoietin of kidney in rats with CAAN. Methods Thirty female Wistar rats were randomLy divided into 3 groups. ①CAAN group(n=10); ②EPO group(n=10); ③SHAM group(n=10); CAAN group and EPO group were infused into stomachs with Caulis aristolochia manshuriensis decoction for 12 weeks. From week 13,EPO group were received EPO by hypodermic injection with 50 IU/kg three times a week for 6 weeks. At weeks 19,All the rats were killed. Specimens of blood and urine were collected to detect the blood urea nitrogen(BUN),Serum creatinie(Scr), Haemato-globin(Hb),urine protein and levels of vWF. HE and Masson staining and micro-scopy were used to observe the pathology of the kidney. Immunohistochemistry were used to detect the expression of vWF. Results Urinary protein, serum creatinine and BUN and levels of vWF in EPO treated group were much lower than those of CAAN group; Hb was increased(both P<0.05). The A value of vWF+ decreased in EPO treated group comparing to CAAN group(P<0.01). Conclusion EPO could deduce the level of vWF and decreased thrombosis.
[Key words] Erythropoietin; Aristolochia acid; Chronic;Rat; Von Willebrand factor
马兜铃酸肾病(Arisolochic acid nephrapathy, AAN)是由于服用含有马兜铃酸(Arisolochic acid, AA)的中草药所致的肾小管间质疾病[1]。虽然对含 AA 中草药的肾毒性认识逐步提高,但研究报道显示:在基层医院含 AA 药物的使用量仍在逐年增加。每年不断出现新发 AAN 病例快速进展至终末期肾脏病(ESRD),给患者、家庭及政府带来沉重的医疗和经济负担[2-3]。目前对AAN的治疗尚无成熟方法。促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)是主要由肾脏分泌的多肽细胞因子,是红细胞增殖、发育过程的重要调节因子[4]。随着人们对 EPO 的生物学效应不断地深入研究,EPO的非造血作用引起巨大关注。Jungers 等[5]的回顾性研究发现 EPO 可以显著延缓慢性肾病的进展。本研究拟观察EPO对CAAN大鼠vWF表达的影响,探讨EPO的肾脏保护作用。
1 材料与方法
1.1实验材料
雌性Wistar大鼠30只,体重190~220 g。购自沈阳药科大学实验动物中心。关木通购自辽宁省中医药大学。人重组EPO由华北制药金坦生物技术有限公司提供。Masson试剂盒购自福建迈新公司。兔抗大鼠vWF多克隆抗体购自丹麦Dako Cyto-mation公司、SABC即用型试剂盒、DAB显色试剂盒、二抗生物素化羊抗兔IgG购自武汉博士德公司。
1.2方法
1.2.1 动物模型制备及分组 参照文献[6]方法制备CAAN动物模型,关木通水煎剂灌胃12周,剂量20 g/(kg·d)相当于10 mL/(kg·d),实验期间大鼠均自由饮食,饮水。雌性Wistar大鼠30只,随机分为三组:CAAN模型组、EPO治疗组、正常对照组,每组各10只,造模结束后,治疗组大鼠予皮下注射重组人EPO每次50 IU/kg,每周3次,共6周。
1.2.2 血、尿生化指标检测 邻苯三酚红钼络合法检测24 h尿蛋白定量,全自动生化分析仪检测血尿素氮(BUN)、血肌酐(SCr)。ELISA法检测外周血vWF含量。
1.2.3肾组织形态学检查 肾组织标本用4%多聚甲醛固定4 h,石蜡包埋,切取4 μm石蜡切片,HE和Masson染色,普通光镜观察。Masson染色纤维化区域染色呈兰色,每张切片随机选取10个不含肾小球的视野(400倍),用显微图象分析仪测定其纤维化区域的积分光密度值(A),代表肾间质纤维化面积。
1.2.4 vWF免疫组织化学染色 4 μm石蜡切片依次经脱蜡,水化及抗原修复,正常山羊血清封闭非特异染色,滴加一抗兔抗vWF多克隆抗体,工作浓度为1∶500,PBS代替一抗为阴性对照。然后滴加二抗生物素化羊抗兔IgG,工作浓度为1∶150,37℃孵育20 min,DAB显色,苏木素复染;系列酒精脱水、透明、封片,镜下观察。用显微图象分析仪对图像进行定量分析。每张切片随机选取10个高倍视野(400倍),测定其阳性物质积分光密度(A)值。
1.3 统计学分析
应用SPSS17.0统计学软件分析处理,其中计量资料用均数±标准差(x±s)表示,组间差异比较采用单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1血、尿生化检查结果
EPO组和CAAN组24 h尿蛋白定量、尿素氮和血肌酐、外周血vWF含量均较正常对照组明显升高,Hb显著下降;与CAAN组比较,EPO组24 h尿蛋白定量、尿素氮和血肌酐、外周血vWF含量均明显降低,Hb有所升高(均P<0.05)。见表1。
2.3 vWF免疫组化染色结果
vWF染色阳性呈黄色或黄棕色细颗粒样沉积在肾间质。正常对照组vWF染色均为阴性,少数血管染色为弱阳性,呈浅黄色。CAAN组vWF阳性表达明显增加,吸光值为(19.36±2.22)。EPO组vWF阳性表达较CAAN组减少,吸光值为(12.37±1.78)。见表2,封三图3。
3 讨论
近20年来,含有马兜铃酸成分的中草药引起的肾脏损害受到国内外的广泛关注。虽然近年来不断有相关实验研究和临床研究报告,但对于马兜铃酸肾病仍无成熟治疗方案,寻求有效的预防及治疗措施是目前医学界关注的热点。有研究报道马兜铃酸肾病在明显的肾间质纤维化之前,肾小管周围毛细血管(PTC)已有明显减少,且PTC减少的程度与肾间质纤维化程度呈正相关[7]。我们课题组前期研究[6,8]发现关木通致CAAN大鼠的肾间质微血管数目明显减少,微血管管壁玻璃样变、断裂,管腔闭塞。这些研究均证明肾间质微血管病变是CAAN发生、发展重要机制。而血管内皮损伤在肾脏微血管丢失中起重要作用。促红细胞生成素是分子量34kDa的一种低分子糖蛋白,是重要的造血生成因子。近来研究表明EPO并不局限于作为红细胞的调节因子,而且在抗凋亡、抗炎、抗氧化等方面发挥着积极作用[9]。在对急性大脑皮层缺血损伤的研究中发现,脑血管内皮细胞EPO受体表达增加,提示EPO可能具有保护内皮的作用,EPO可阻止低氧诱导的脑血管内皮损伤[10]。
基于以上机制,本研究复制CAAN动物模型给予EPO治疗,治疗组大鼠尿蛋白排泄量,尿素氮,血肌酐明显减少,提示EPO治疗可以改善CAAN大鼠的肾功能。我们发现CAAN大鼠血vWF水平显著升高,肾组织vWF的阳性表达增加;治疗组大鼠血vWF水平下降,肾组织vWF的阳性表达减少。vWF主要由血管内皮细胞和巨核细胞合成,并储存在血管内皮细胞的Weibel-Palade小体中,在血管内皮细胞损伤后可参与血栓的形成[11],因此vWF常被作为检测内皮细胞损伤程度的指标[12]。治疗后vWF的显著下降,说明EPO治疗可以减轻CAAN大鼠的内皮细胞损伤。同时研究发现EPO治疗组肾间质纤维化区域较CAAN组明显减小,我们推测EPO治疗可以减少肾脏微血管的内皮细胞损伤进而减少肾脏微血管的丢失,延缓肾间质纤维化的进展。
综上,EPO治疗CAAN具有改善贫血以外的血管内皮保护作用,为EPO治疗CAAN提供实验依据。
[参考文献]
[1] Vanherweghen JL. Rapidly progess interititial renal fibrosis in young women:association with slimming regimen including Chinese herbs[J]. Lancet,1993,341(8842):387-391.
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[5] Jungers P,Choukroun G,Oualim Z,et al. Beneficial influence of rhuEPO therapy on the rate of progression of chronic renal failure in predialysis patients[J]. Nephrol Dial Transplant,2001,16(2):307-312.
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(收稿日期:2014-01-15)
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(收稿日期:2014-01-15)