小胶质细胞与白介素在帕金森病发病机制中作用的实验研究※

陈 培孔祥盼杨晓帆

小胶质细胞与白介素在帕金森病发病机制中作用的实验研究※

陈 培1孔祥盼2杨晓帆2

目的研究分析小胶质细胞和白介素在帕金森病（PD）中对发病机制的作用。方法采取立体定向术把嗜神经毒素6-羟基多巴（即为6-OHDA）注射进大鼠右侧文状体做成偏侧PD大鼠模型。在造模2个月后，将黑质致密度部神经元与小胶质细胞数目加以计数。应用免疫组织化学法监测黑质致密部白介素的表达水平改变情况。结果在光镜视下，注意模型组大鼠右侧黑质致密部多巴胺能神经元已消失，而小胶质细胞计数数目显著性增多，和假手术组、正常对照组比较差异P＜0.05，有统计学意义。免疫组化染色发现模型组大鼠右侧黑质致密部可以看见显著的小胶质细胞核周围存在白介素的表达，为棕褐色。但是模型组在左侧黑质，假手术组及正常对照组在右侧黑质未发现显著的白介素表达。结论嗜神经毒素6-OHDA能促使神经元释放出小胶质细胞并激活态物质，小胶质细胞被激活释放出白介素产生介导细胞毒性的作用，加快神经元发生慢性变形坏死现象。

小胶质细胞；白介素；帕金森病；发病机制；实验研究

帕金森病（简称PD）的致病因素和发病机制还未十分清楚。最近阶段研究提出脑内炎症反应主要是细胞因子的形成及释放，小胶质细胞被激活后可能会参与PD的发病[1]。本组实验利用文状体双靶点将神经毒素6-OHDA注入大鼠体内做成PD大鼠模型，注意小胶质细胞数目水平的变化及包借宿于黑质致密部中的表达情况，进而研究免疫细胞因子与小胶质细胞于PD发病机制中发挥的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料 雄性健康的大鼠 34只，平均体重（210±12）g，随机将其分成三组，模型组18只，假手术组8只，正常对照组8只。

1.2 方法

1.2.1 选取标本 用 10%浓度的水合氯醛进行麻醉以后，先后在心腔内灌注生理盐水与4%浓度的多聚甲醛进行内固定，断头取其脑。标本在10%浓度中性福尔马林溶液内固定7天，用石蜡加以包埋，然后切片，其片厚是4μm。标本选取前卤前 0.6mm、前囱后0.2mm层面，和前囱后4.8～5.4mm层面处的不同部位。对黑质致密部多巴胺能神经元与小胶质细胞产生数目加以计数。

1.2.2 白介素免疫组化染色 选用链霉素抗生素蛋白-过氧化酶法染色，以4μm厚度切片石蜡，然后脱蜡至入水，用PH值为6.0的0.01mmol/L柠檬酸盐缓冲液加入其内，加热到98℃进行抗原修复，过氧化氢甲醇加以阻断，在室温中孵育。用羊血清对其封闭，在室温孵育。然后加入特异性白介素，置于4℃环境过夜。再加生物素化二抗，于室温中孵育。添加链霉素康生物素-过氧化物酶溶液，在室温中孵育，用DAB进行显色。用苏木素进行衬染。用PBS代替阴性对照一抗[2]。

1.3 统计学方法采用实验数据用（±s）表示，全部数据在统计学软件SPSS 14.0上加以处理，模型组中大鼠左、右侧比较应用配对t加以检验，组建数据比较应用单因素χ2检验。

2 结果

2.1 黑质致密部神经元细胞数目详见表1。模型组大鼠右侧显著降低，和假手术组大鼠右侧与正常对照组大鼠右侧比较，差异P＜0.05有统计学意义。

表1 三组大鼠黑质致密带多巴胺能神经元数目的计数情况表(±s)

表1 三组大鼠黑质致密带多巴胺能神经元数目的计数情况表(±s)

组别 例数 左侧 右侧模型组 18 98.21±20.86 31.71±15.94假手术组正常对照组88 109.66±11.44 93.32±10.77 118.16±21.97 101.82±16.24

2.2 黑质致密部小胶质细胞数目的计数情况详见表2。模型组大鼠右侧显著增多，和假手术组大鼠右侧与正常对照组大鼠右侧比较，差异P＜0.05有统计学意义。

表2 三组大鼠黑质致密部小胶质细胞数目的计数情况表(±s)

表2 三组大鼠黑质致密部小胶质细胞数目的计数情况表(±s)

组别 例数 左侧 右侧模型组 18 31.11±3.12 60.21±9.94假手术组正常对照组88 33.02±4.75 36.31±6.29 33.82±4.25 34.49±5.10

2.3 病理学观察

2.3.1 黑质致密部HE染色 在模型组大鼠左侧黑质致密部存在大量多巴胺能神经元，其包体包浆为嗜伊红染色和条带状排列。而模型组大鼠右侧黑质致密部没有多巴胺能神经元，且残留的神经元出现萎缩，其条带状排列不显著。

2.3.2 白介素黑质致密部免疫组织学染色 在模型组大鼠右侧黑质致密部能看见显著棕褐色呈阳性表达，主要分布于梭形、短杆形以及三角形的小胶质细胞核周。但是模型组大鼠左侧无显著的阳性染区。假手术组和正常对照组大鼠左、右侧黑质区无显著阳性染区。

3 讨论

帕金森病（PD）致病因素和发病机制多是利用动物模型实验完成的，现阶段还没有完美理想的模型。本组实验应用纹状体内双靶点6-OHDA的注射方法，利用神经元轴突具有的逆行性吸收作用，将黑质损坏。在实验中注意模型组在注药一侧黑质多巴胺能神经元比假手术组和正常对照组显著降低。在PD患者中，黑质特异性的小胶质细胞被高度激活及阳性表达。本组实验注意模型组大鼠右侧黑质小胶质细胞的计数增多，且使用免疫组织化学法验证了小胶质细胞在胞浆中有白介素表达，也证实了小胶质细胞介导损害了多巴胺能神经元产生的炎性反应[3]。在PD动物模型中，其小胶质细胞被激活以后，产生的白介素于损伤一侧黑质致密部的实验表达存在特异性。表明其介导损害的神经元有攻击作用。促进神经元的变性及死亡。但是很可能是PD免疫受损的原因之一。小胶质细胞受T淋巴细胞的影响，产生其它的大量物质，主要是诱发炎症、活性氮类及活性氧类的前列腺素，而此类化学物质也对神经变性具有促动作用。

通过本组实验可知，PD发病过程中，小胶质细胞和被激活出现的免疫细胞因子对注药侧黑质多巴胺能神经元产生毒性作用。其免疫反应致使PD为慢性病程给予了实验依据，进一步给临床中使用抑制免疫类药物提供参考支持。

[1] 董丽华,胡国华.神经胶质细胞在帕金森病发病机制中的作用[J].中风与神经疾病杂志,2010,21(4):338-340.

[2] 周媛,李洁,刘春风.小胶质细胞在帕金森病发病学中的作用[J].国外医学(老年医学分册),2010,26(5):211-212.

[3] 裴正斌,彭国光.小胶质细胞在帕金森病中的双重作用[J].中国临床康复,2010,8(1):130-131.

R742.5

A

1673-5846(2014)01-0216-02

1 牡丹江医学院，黑龙江牡丹江 157011

2 牡丹江医学院红旗医院，黑龙江牡丹江 157011

黑龙江省教育厅科学技术研究项目，编号：12531734

杨晓帆，E-mail：qingqingfanying@sina.com。