牛红细胞抗菌肽对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌活性

张庆华,王青,尚田田,赵志雨,徐彦召,胡建和

（河南科技学院,河南新乡453003）

牛红细胞抗菌肽对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌活性

张庆华,王青,尚田田,赵志雨,徐彦召,胡建和

（河南科技学院,河南新乡453003）

通过琼脂平板法测定了牛红细胞抗菌肽SP-18对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的抑菌活性,以微量肉汤稀释法测定其对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度（MIC）,并在扫描电镜（SEM）下观察其对细菌生物膜的影响.结果表明：SP-18对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌有明显的抑制活性,MIC分别为1.0 mg/mL、0.25 mg/mL；SEM观察发现抗菌肽作用后细菌生物膜发生皱缩、破裂,金黄色葡萄球菌发生膜裂解,大肠杆菌表面出现孔洞结构.研究表明SP-18具有良好的抗菌活性,并通过破坏细菌生物结构的作用机制发挥抑菌效果,在抗菌肽未来的开发应用中具有良好的前景.

红细胞抗菌肽；抑菌活性；扫描电镜观察

近年来,抗生素的滥用造成药物残留和细菌耐药性问题日渐突出,对畜牧业发展和人类健康造成巨大威胁[1].某些抗生素在很多国家已经被禁用,致使新型抗菌药物的研发变得更为迫切[2].抗菌肽作为生物机体的防御效应因子在自然界中普遍存在,是参与生物体自身免疫的第一道防线[3].抗菌肽在生物体的先天性免疫方面起着重要的作用,如辅助免疫细胞对抗外来抗原、消灭炎症等[4].目前研究表明,许多天然抗菌肽对临床常见的耐药细菌、病毒具有良好的杀灭效果.中科院张云课题组研究发现：蛇毒抗菌肽OH-CATH30对临床常见的500多种耐药细菌具有较强的抑菌效果,对正常哺乳动物细胞毒性及溶血性较低[5].Hood等对蜜蜂蜂毒中提取的一种抗菌肽Melittin研究发现,Melittin可以破坏HIV的外层衣壳蛋白,直接杀灭HIV病毒[6].抗菌肽对病原微生物具有高效、广谱、作用机制独特及不易引发耐药性等特点,是目前国际公认的抗生素最佳替代品.

牛红细胞抗菌肽SP-18是本课题组由牛血红素α-亚基中分离提取的一种线性抗菌肽.本试验通过活性检测、扫描电镜观察的方法,对SP-18进行活性鉴定分析.

1 材料与方法

1.1 试验材料

SP-18（上海吉尔生化公司产品）；金黄色葡萄球菌ATCC29213、大肠杆菌ATCC25922为本实验室保存菌种；氨苄青霉素、胰蛋白胨、MH肉汤培养基、TSB均购自Solarbio公司；其他试剂为国产分析纯试剂.

1.2 试验仪器

Legend Mach 1.6R高速离心机（美国Thermo Scientific公司）；Varioskan Flash多功能酶标仪（美国Thermo Scientific公司）；Alpha 1-4LSC真空冷冻干燥仪（德国MARIN CHRIST公司）；Quanta 200FEG环境扫描电子显微镜（美国FEI公司）.

1.3 试验方法

1.3.1 抑菌活性及MIC测定配制2 mg/mL的SP-18溶液,琼脂糖弥散法测定不同温度下P3的抑菌活性.用TSB液体培养基培养测试细菌至对数生长期,菌悬液离心、洗涤,于平皿内加入高压灭菌的底层培养基,待凝固后打3个孔（孔径小于2.5 mm）,每孔加入约10 μL SP-18溶液.以10 mg/mL的氨苄青霉素为阳性对照,无菌去离子水为阴性对照.将加样品后的平皿倒置于37℃培养箱内,3 h后倒入覆盖琼脂, 37℃过夜培养,观察结果.

微量肉汤稀释法测定抗菌肽对测试菌株的MIC.TSB液体培养基过夜扩大培养测试细菌,随后在600 nm处测定OD值（0.6～0.8）,6 000 r/min,离心10 min,弃上清,等量0.01 mol/L PBS重悬细菌.用MH肉汤培养基将待测细菌稀释到2×106CFU/mL.去离子水倍比稀释抗菌肽溶液（2 mg/mL～31.25 μg/mL）.于细胞培养板,每孔添加50 μL血红蛋白抗菌肽稀释液和50 μL稀释菌液,每个浓度3个重复,37℃培养16～20 h,以小孔内细菌完全不生长的浓度即为SP-18最小抑菌浓度.

1.3.2 扫描电镜观察培养至对数生长期的正常细菌及添加抗菌肽孵育后的菌悬液各5 mL,3 000 r/min,离心5 min,PBS溶液洗涤沉淀细菌2次,弃上清.体积分数为2.5%的戊二醛溶液5 mL,重悬菌液,固定3 h以上,滴加细菌固定液于8 mm圆形盖玻片上,4℃下自然沉淀1 h,将盖玻片分别放置于体积分数为60%、70%、80%、90%、100%的乙醇溶液中梯度脱水20 min,100%乙醇2次.真空冷冻干燥仪干燥样品6 h后,经离子溅射仪喷金,于扫描电镜下观察.

2 结果与分析

2.1 抑菌活性及MIC

不同浓度SP-18作用下金黄色葡萄球菌和大肠杆菌生长情况见表1.

表1 不同浓度下细菌生长情况Tab.1 The growth of bacteria in different concentration of hemoglobin antimicrobial peptide

金黄色葡萄球菌、大肠杆菌琼脂平板试验结果显示,牛红细胞抗菌肽的样品孔周围均出现明显的抑菌圈,大肠杆菌平板抗菌肽抑菌圈直径大于金黄色葡萄球菌平板抑菌圈直径.微量肉汤稀释法MIC测定结果发现：SP-18对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的最小抑菌浓度分别为1 mg/mL、0.25 mg/mL.

2.2 扫描电镜观察结果

正常培养的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌及其经过抗菌肽作用后的细菌形态扫描电镜观察结果如图1所示.

图1 不同细菌形态的观察Fig.1 Observation of the morphology of tested bacteria

扫描电镜观察结果发现：正常培养的金黄色葡萄球菌排列呈葡萄串状（图1-A）,个体大小均匀,近似圆形,表面光滑,无鞭毛、芽孢.抗菌肽作用后金黄色葡萄球菌发生团状聚集（图1-C）,细菌大小变化不一,细胞膜发生皱缩、破裂.正常培养的大肠杆菌呈两端钝圆、无芽孢的短杆菌,细菌形态饱满、表面光滑（图1-B）.抗菌肽作用后的大肠杆菌表面发生凹陷、皱褶,细菌膜表面出现孔洞样结构（图1-D）.

3 讨论

2010年携带NDM-1基因的“超级细菌”出现并在全球范围内快速传播,对临床常用抗生素具有极强的抵抗能力,人们几乎无药可用[7-8].传统抗生素进入细胞内部,通过扰乱或阻断其正常的生长代谢途径发挥抑菌效果.而细菌在长期的进化过程中通过基因突变、改变药物靶位结构、自身合成抗生素降解酶或修饰酶等方式能躲避多种抗生素[9].而耐药基因在细菌之间的相互传播,造成细菌广泛性耐药问题.

抗菌肽主要是通过电荷吸引作用吸附于细菌细胞膜表面,使细胞膜发生去极化,并形成疏水性低聚物插入细菌膜内部,引起细胞内容物流失,细胞膜裂解.与传统抗生素杀菌作用机制不同,抗菌肽是以物理损伤的方式,消灭细菌,理论上细菌无法躲避.通过本试验,对所分离的红细胞抗菌肽抑菌活性进行了初步的研究,结果发现：红细胞抗菌肽对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌表现良好的抑菌活性,造成细菌细胞膜发生明显的皱缩、裂解,从而发挥抑菌活性.

[1]Fischbach M A,Walsh C T.Antibiotics for emerging pathogens[J].Science,2009,325（5944）：1089-1093.

[2]马青山,李艳,张金凤.抗生素在畜牧业中的负面效应及对策[J].饲料研究,2012（4）：39-40.

[3]Hancock R E,Lehrer R.Cationic peptides：a new source of antibiotics[J].Trends in Biotechnology,1998,16（2）：82-88.

[4]Lai Y P,Gallo R L.AMPed up immunity：how antimicrobial peptides have multiple roles in immune defense[J].Trends in Immunology,2009,30（3）：131-141.

[5]Li S A,Lee W H,Zhang Y.Efficacy of OH-CATH30 and its analogs against drug-resistant bacteria in vitro and in mouse models[J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy,2012,56（6）：3309-3317.

[6]Hood J L,Jallouk A P,Campbell N,et al.Cytolytic nanoparticles attenuate HIV-1 infectivity[J].Antiviral therapy,2013,18（5）：95-103.

[7]Moellering R C Jr.NDM-1：a cause for worldwide concern[J].The New England Journal of Medicine,2010,363（25）：2377-2379.

[8]Kumarasamy K K,Toleman M A,Walsh T R,et al.Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in India,Pakistan,and the UK：a molecular,biological,and epidemiological study[J].The Lancet infectious diseases,2010,10（9）：597-602.

[9]Grove T L,Benner J S,Radle M I,et al.A radically different mechanism for S-adenosylmethionine-dependent methyltransferases[J]. Science,2011,332（6029）：604-607.

（责任编辑：邓天福）

Inhibition of the antibacterial activity of bovine red blood cell antimicrobial peptide to Staphylococcus aureus and Escherichia coli

Zhang Qinghua,Wang Qing,Shang Tiantian,Zhao Zhiyu,Xu Yanzhao,Hu Jianhe
（Henan Institute of Science and Technology,Xinxiang 453003,China）

The bioactivity of novel bovine red blood cell antimicrobial peptide SP-18 to Staphylococcus aureus, Escherichia coli was tested by agar gel diffusion method in this paper.The minimal inhibitory concentration of bovine red blood cell antimicrobial peptide to S.aureus,E.coli was tested by broth micro-dilution method.The morphology of bacterias was observed by scanning electron microscope.The results showed that SP-18 have inhibitory action to tested bacteria,the MIC to S.aureus and E.coli were 1.0 mg/mL and 0.25 mg/mL,respectively.The cell membrane of tested bacteria were observed shrinking,distorting.The cell membrane of S.aureus was cracked.The surface of E.coil has many holes.These results indicated red blood cell antimicrobial peptide restrained the bacteria by damaging its cell membrane,which had a potential advantage in the development and application.

redbloodcell antimicrobial peptide；antibacterial activity；observation withscanningelectron microscope

S859.79+7

A

1008-7516（2014）02-0035-04

10.3969/j.issn.1008-7516.2014.02.009

2014-03-12

国家自然科学基金（31372469）

张庆华（1988-）,男,河南开封人,硕士研究生.主要从事动物微生物学研究.

徐彦召（1984-）,男,河南许昌人,讲师.主要从事动物微生物学、免疫学研究.胡建和（1968-）,男,河南辉县人,教授,硕士生导师.主要从事动物微生物学研究.