临沧市2012年高效抗反转录病毒治疗失败的AIDS患者耐药基因变异分析

杨翕然，杨翠先，杨绍敏，边中启

临沧市2012年高效抗反转录病毒治疗失败的AIDS患者耐药基因变异分析

杨翕然，杨翠先，杨绍敏，边中启

目的了解临沧市2012年经高效抗反转录病毒治疗（highly active antiretroviral therapy,HAART）失败的AIDS患者耐药基因的变异情况。方法调查HAART失败AIDS患者的流行病学特征，检测CD4+T淋巴细胞计数和病毒载量，对HIVRNA＞1×103copies/m l的患者行HIV-1耐药基因检测。结果66例中有53例检出基因耐药突变。最常见的核苷类反转录酶抑制剂耐药突变位点为M184V、D67N和K70R，非核苷类反转录酶抑制剂耐药突变位点为K103N、G190A和V179D。仅发现3个蛋白酶抑制剂突变位点，分别为D33F、M46I和L76V。结论临沧市AIDS患者出现较多反转录酶抑制剂突变位点是一线抗反转录病毒治疗失败的主要原因。在选择二线治疗方案时，增加蛋白酶抑制剂可避免多重耐药导致的治疗失败。

获得性免疫缺陷综合征；抗逆转录病毒治疗，高效；抗药性

高效抗反转录病毒治疗（highly active antiretroviral therapy,HAART）能有效降低HIV感染者的发病率和病死率，使已被破坏的免疫功能得到重建，大大降低母婴传播的几率。但随着HAART的广泛开展，在药物选择压力下出现了交叉耐药和多重耐药[1-2]。为了解云南省临沧市一线抗病毒治疗失败AIDS患者的耐药情况，我们对2012年临床治疗失败的AIDS患者进行耐药基因检测，以期为二线治疗方案的选择提供依据。

1 对象与方法

1.1 对象66例为2012年临沧市一线抗病毒治疗失败的AIDS患者，于当地检测HIV RNA载量和CD4+T淋巴细胞计数后，将血浆样本送至我院行HIV-1耐药基因检测，并收集其临床及流行病学资料。入选标准：抗病毒治疗＞6个月，HIV RNA＞1× 103copies/ml和（或）CD4+T淋巴细胞计数低于治疗前基线水平。

1.2 方法根据《国家免费艾滋病抗病毒药物治疗手册》[3]，治疗方案为2种核苷类反转录酶抑制剂（nucleoside reverse transcriptase inhibitors,NRTIs）联合1种非核苷类反转录酶抑制剂（non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors,NNRTIs）或蛋白酶类抑制剂（protease inhibitors,PIs）。采集治疗失败患者的临床资料和随访信息，用美国BD FACSCalibur流式细胞仪检测CD4+T淋巴细胞绝对计数，西门子Versant Molecular 440检测病毒载量。对HIV RNA＞1×103copies/ml者用美国Abbottm2000sp进行核酸提取，采用反转录套式聚合酶链反应扩增HIV pol区DNA，扩增产物送至北京诺赛基因组研究中心测序。得到长度约1300 bp，包括HIV-1 pol区基因序列的蛋白酶基因全长1～99氨基酸和反转录酶基因至少前1～254个氨基酸。用ContigExpres软件进行序列的整理和拼接，将结果上传至美国斯坦福大学HIV耐药数据库进行耐药基因型分析，并对样本的药物敏感性进行分析，分为敏感、潜在耐药、低度耐药、中度耐药和高度耐药，敏感和潜在耐药归为敏感，低度及以上耐药记为耐药。

2 结果

2.1 一般情况66例中男38例，女28例；年龄18～76岁，平均36岁。异性性传播46例（69.7%），通过静脉吸毒传播15例（22.7%），母婴垂直传播1例（1.5%），感染途径不详4例（6.1%）。其中49例（74.2%）正在服用复方磺胺甲噁唑。开始抗病毒治疗时间为10～72个月，平均29个月。HAART方案组合为齐多夫定（AZT）+拉米夫定（LAM）+奈韦拉平（NVP）（48.5%，32/66）、AZT+LAM+依非韦伦（EFV）（28.8%，19/66）、司他夫定（d4T）+LAM+ NVP（15.2%，10/66）、d4T+LAM+EFV（6.1%，4/66）、LAM+洛匹那韦/利托那韦（1.5%，1/66）。66例的CD4+T淋巴细胞计数和HIV RNA载量见表1。53例样本扩增成功，其中单药耐药22例（41.5%），2种及以上多重耐药31例（58.5%）。

表1 66例患者CD4+T淋巴细胞计数和HIV RNA载量Table 1 CD4+T lymphocyte count and HIV RNA load of 66 patients

2.2 NRTIs耐药情况53例中对NRTIs耐药者33例（62.3%），与NRTIs相关的主要耐药突变位点有11个，最常见的为M184V（31例）、D67N（5例）、K70R（4例）、M41L（3例）和T215F（3例），突变率分别为58.5%、9.4%、7.5%、5.7%和5.7%。

2.3 NNRTIs耐药情况53例中对NNRTIs耐药者49例（92.5%），主要的相关耐药突变位点有18个，最常见的为K103N（29例）、G190A（9例）、V179D（9例）、Y181C（7例）和P225H（7例），突变率分别为54.7%、17.0%、17.0%、13.2%和13.2%。

2.4 PIs耐药情况53例中仅1例对PIs耐药。与PIs相关的耐药突变位点是D33F、M46I和L76V，突变率为1.9%。

3 讨论

HIV耐药的产生主要是由于病毒反转录酶与蛋白酶的基因突变，从而导致对药物的敏感性降低[4]。本研究中突变率最高的为M184V（58.5%），31例M184V突变者均对LAM显示高度耐药。然而LAM的耐药变异可反转AZT的耐药株，使其恢复对AZT的敏感性，并延缓AZT耐药株的出现，因此LAM耐药株的出现对LAM+AZT的联合应用影响不大[5]。M184V还可阻碍或延迟腺苷类耐药突变的发生[6]。有文献报道M41L和T215F突变可能导致对AZT和d4T耐药[7]。本研究中3例T215F突变者均对AZT和d4T高度耐药；3例M41L突变者中有2例对AZT和d4T高度耐药，1例为潜在耐药。目前尚未发现D67N和K70R与哪些耐药相关，待进一步研究。

有文献报道，5%～15%的HIV新近感染者至少存在1个对某种抗反转录病毒药物耐药的变异，NNRTIs的初始耐药率最高，在美国为6.9%；NRTIs和PIs的初始耐药率分别为3.6%和2.4%[8]。本研究中NNRTIs突变率最高的为K103N（54.7%），被认为与EFV和NVP耐药相关，29例K103N突变者均显示对EFV和NVP高度耐药；G190A与EFV和NVP耐药高度相关，9例G190A突变者均对EFV和NVP中度以上耐药，这与之前云南省的报道一致[9]。V179D曾被认为与NNRTIs的低度耐药相关，但对包含NNRTIs方案的有效性并无意义，当V106I与V179D联合突变时，已被证明可导致EFV耐药[10]。本研究未发现V106I突变。Y181C与NVP和地拉夫定耐药高度相关[11]，本组有7例Y181C位点突变。53例样本中，仅发现1例对PIs耐药，该患者M46L和L76V位点发生突变，提示其对除阿扎那韦、沙奎那韦及替拉那韦外的PIs均耐药；另1例L33F发生突变，但未显示耐药。蛋白酶基因表达的主要区域为D30N和M46I，若发生突变将对PIs耐药产生重要作用，M46I突变会对除沙奎那韦以外茚地那韦、利托那韦、安普那韦和奈非那韦多种PIs产生耐药[12]。

本组53例耐药者中，多重耐药率达58.5%，主要为NRTIs和NNRTIs耐药，这与我国的一线治疗方案为2种NRTIs+1种NNRTIs有关。而作为二线治疗方案中的PIs由于应用较少，耐药率较低。当发生NNRTIs耐药时通常选用的方案为2种敏感的NRTIs+PIs；当对某一种PIs耐药时，可考虑使用其他更强效的PIs[13]。当出现多位点突变时，突变位点之间的相互作用反而会降低病毒对某种药物的耐受，部分耐药位点会改变病毒的关键蛋白，使病毒复制力下降，当中断抗病毒治疗后，耐药株会快速被野生型毒株所替代[14]。服药依从性也是HAART成功与否的关键，由于药物的不良反应以及须长时间、多次服药，容易导致服药依从性不良，最终产生耐药。在治疗开始前，充分评估药物敏感性，选择恰当的方案，避免交叉耐药，加强AIDS患者的依从性教育，可有效减少耐药发生。

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（2013-09-12收稿 2013-12-18修回）

（责任编委 张玲霞 本文编辑 陈玉琪）

Drug resistancemutations in AIDS patients failing highly active antiretroviral therapy in Lincang,Yunnan province,in 2012

YANG Xi-ran,YANG Cui-xian,YANG Shao-min*,BIAN Zhong-qi
AIDSCare Center Laboratory,Yunnan Provincial Hospital of Infectious Diseases,Kunming,Yunnan 650301,China
*Corresponding author,E-mail:smy57@sina.com

Objective To investigate HIV drug resistance mutations in AIDS patients failing highly active antiretroviral therapy(HAART)in Lincang,Yunnan province,in 2012.M ethods Epidemiological characteristics of AIDS patients failing in HAARTwere investigated.CD4+T lymphocyte count and viral load were detected,and HIV-1 resistance testing was conducted on those patients with viral load more than 1000 copies/m l.Results Among 66 patients failing in HAART,drug resistance mutations were found in 53 patients.Themost common nucleoside reverse transcriptase inhibitor resistancemutations were M184V,D67N and K70R,and non-nucleoside reverse transcriptase inhibitor resistance mutations were K103N,G190A and V179D.Only 3 protease inhibitor(PI)resistancemutations were found,and they were D33F,M46I and L76V,respectively.Conclusions The emergence of reverse transcriptase resistancemutations is themain reason for the failure of first-line antiretroviral therapy(ART)in AIDS patients in Lincang,Yunnan province.Therefore,when switching to second-line ART,the increased use of PI can avoid ART failure due to multidrug resistance.

acquired immunodeficiency syndrome;antiretroviral therapy,highly active;drug resistance

R512.91；R915

A

1007-8134(2014)03-0164-03

国家“十一五”科技重大专项（2012ZX10001-002）

650301昆明，云南省传染病专科医院艾滋病关爱中心检验科[杨翕然（现在昆明医科大学研究生部）、杨翠先、杨绍敏]；650032，成都军区昆明总医院感染科（边中启）

杨绍敏，E-mail:smy57@sina.com