CD83＋成熟树突细胞和CD11b＋耐受性树突细胞在人颈动脉粥样硬化病变中的分布

邓琼，胡何节，方征东，王晓天，孙小杰

（安徽医科大学附属省立医院、安徽省立医院血管外科，合肥 230001）

CD83＋成熟树突细胞和CD11b＋耐受性树突细胞在人颈动脉粥样硬化病变中的分布

邓琼，胡何节，方征东，王晓天，孙小杰

（安徽医科大学附属省立医院、安徽省立医院血管外科，合肥 230001）

目的探讨CD83＋成熟树突细胞（mDC）和CD11b＋耐受性树突细胞（tolDC）在人颈动脉粥样硬化病变中的分布。方法收集颈动脉狭窄患者行颈动脉内膜剥脱术的颈动脉内膜标本20例，常规石蜡切片，HE染色，免疫组织化学染色观察CD83和CD11b阳性反应血管树突状细胞的分布。结果CD83＋mDC和CD11b＋tolDC主要分布在颈动脉内膜斑块、泡沫细胞以及新生血管周围，成熟的CD83＋mDC细胞密度（8.34 ±1.20）个细胞／HPF较CD11b＋tolDC细胞密度（5.31±1.24）个细胞／HPF高。结论CD83＋mDC和CD11b＋tolDC在人颈动脉粥样硬化动脉内膜均有分布，mDC的增多和tolDC的减少可能与人颈动脉粥样硬化发生发展有关。

颈动脉狭窄；树突细胞；细胞计数

颈动脉粥样硬化（CAS）所致的颈动脉狭窄是目前威胁人类健康的主要疾病之一，研究认为动脉粥样硬化是一种慢性炎症免疫性疾病，炎症和免疫是CAS发病的重要环节［1］。目前树突细胞（DCs）是已知的体内功能最强大的专职抗原提呈细胞（APC），DC对自身抗原异常提呈，通过激活局部T淋巴细胞，来启动由多种细胞参与的免疫炎性反应，从而在CAS病理演进中扮演着重要的角色［2-3］，mDC表达CD83［4］而tolDC表达CD11b［5］，目前国内外有关CAS的研究其对象多为动物模型，有关DCs的研究也多为mDC而对tolDC研究较少，本文以CAS患者的病变动脉内膜为研究对象，通过免疫组织化学技术对颈动脉内膜中的CDl1b和CD83分子进行检测，探讨mDC和tolDC在CAS病变中的分布。

图1 CAS患者HE染色病理学改变（×400)

图2 CD83和CD11b在CAS组中的表达(SP法，×400)

1 材料和方法

1.1 临床标本 收集2011年10月至2013年5月安徽省立医院血管外科颈动脉狭窄患者行颈动脉内膜剥脱术获得的颈动脉内膜标本20例（经医院伦理委员会同意并患者知情同意），标本均经10%甲醛固定。患者年龄48～72（64.2±10.7）岁，其中男性患者12例，女性患者8例，合并高血压者14例，合并糖尿病者5例，根据以下标准确诊：①临床表现具有典型的临床特征，②颈动脉彩色多普勒超声或者颈动脉CTA，③组织病理学诊断。所有患者在就诊2月内没有使用免疫调节剂治疗，亦未合并自身免疫性疾病和（或）恶性肿瘤。

1.2 主要试剂 兔抗人CD83单克抗体（LSC176864）购自LSBio公司，兔抗人CD11b单克抗体（ab1333571）购自Abcom公司，SP-9000免疫组织化学染色试剂盒，DAB酶底物显色剂均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 免疫染色方法 用10%中性甲醛固定，常规石蜡包埋，制成5 mm厚的连续切片，所有标本各取两张分别用CD11b抗体和CD83抗体进行免疫组织化学染色，用PBS代替一抗作阴性对照。免疫组织化学步骤如下：切片脱石蜡、水化、抗原修复，依次滴加过氧化物酶阻断剂、封闭血清、一抗、生物素标记的二抗、链霉素抗生物素一过氧化物酶溶液，DAB显色，复染，封片。

1.4 染色结果判断标准［6］①树突细胞计数：细胞计数采用OlympusBX40显微镜在×400下观察。染色强度采用OlympusUPlanFL×40的物镜观察：显示细胞质染色或膜染色的细胞都包括在阳性细胞计数中。每张免疫组织化学切片随机取5个高倍视野进行CD11b或CD83阳性细胞计数，再分别取其平均数进行统计学分析，即每高倍视野的细胞数／HPF。②CD11b细胞判定标准：染色后的切片置光镜下观察，细胞质或细胞膜呈黄褐色，且具有不规则树枝状突起的细胞为CD11b＋细胞。③CD83细胞判定标准：以细胞膜或细胞质呈现黄褐色染色，且具有不规则树枝状突起的细胞为CD83＋细胞。

1.5 统计学处理 采用SPSS17.0统计软件分析，CD11b和CD83在CAS组织中表达的差异采用独立样本t检验。

2 结果

2.1 HE染色结果 颈动脉内膜变性，局部管壁斑块增厚，可见胆固醇结晶和钙盐沉积，少量淋巴细胞、泡沫细胞、红细胞和多核巨细胞浸润，外膜面纤维组织增生伴玻璃样变性（图1）。

2.2 免疫组织化学检测结果 20例CAS病变组织中，耐受性树突细胞由CD11b特征性标记，成熟树突细胞由CD83特征性标记，成熟的CD83＋树突细胞和耐受性的CD11b＋树突状细胞主要分布在内膜斑块处以及泡沫细胞、新生滋养血管周围（图2），CD83表达明显多于CD11b，CD83＋mDC细胞密度为（8.34±1.20）个细胞／HPF，CD11b＋tolDC密度为（5.31±1.24）个细胞／HPF，两者相比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨论

本实验所取标本均能肉眼可见AS斑块，行HE染色可见颈动脉内膜变性，局部管壁增厚，伴有胆固醇结晶及钙盐的沉积，以及淋巴细胞等免疫细胞的浸润，从病理分析：人颈动脉随着年龄的增长而逐渐出现退行性改变，动脉内膜更易受到某些侵袭因素破坏导致内膜屏障功能减低，发生CAS的风险增加。此外我们通过免疫组织化学染色发现CD83＋mDC在颈动脉内膜大量分布，尤其丰富在不稳定斑块、泡沫细胞以及新生滋养血管周围，而CD11b＋tolDC少量分布于颈动脉内膜，主要分布在新生滋养血管周围，并且CD83＋mDC细胞密度高于CD11b＋tolDC细胞密度［7-9］，Yilmaz等［10］研究发现在不稳定斑块肩部区域有活性的DC与T细胞成簇分布，大量表达CD83等标志物，本实验与Yilmaz等的研究结果相一致。本研究证实tolDC和mDC在颈动脉粥样硬化内膜均有分布，tolDC细胞密度与mDC细胞密度比较，差异具有统计学意义，这说明tolDC细胞在AS病变颈动脉内膜的分布的减少和mDC在其分布的增多与CAS病变的发生发展密切相关，至于两者在CAS病变中具体的参与机制有待进一步研究。

本研究证实CAS存在一定的免疫反应来抵御病变的进一步发展，国内外大量研究表明mDC不但参与了AS的发生发展，而且促进了AS的斑块形成及发展成为不稳定性斑块，tolDC能诱导调节性T细胞下调免疫反应，本研究发现tolDC在颈动脉内膜少量分布，这或许表明tolDC的缺乏不足以引起抑制炎症的免疫反应来抵御AS的病变进展，为了抑制炎症的进展，可以设想诱导tolDC形成而建立细胞免疫疗法来治疗CAS等AS疾病，实现免疫细胞多靶点多环节的调控，具有重要的理论意义和应用价值，但是需要进一步的研究来寻求有效的方法诱导和释放tolDC而又不丢失它的免疫耐受功能。

（本文图1，2见插图1-1）

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The distribution of CD83＋mDC and CD11b＋tolDC in human carotid atherosclerotic lesions

DENGQiong，HU Hejie，FANGZhengdong，WANGXiangtian，SUN Xiaojie（Vascular Surgery，Anhui Provincial Hospital，Hefei 230001，China）

ObjectiveTo investigate the distribution of CD83＋mature dendritic cell（mDC）and CD11b＋tolerogenic dendritic cell（tolDC）in human carotid batherosclerotic lesions.Methods A total of 20 carotid intima specimens were collected as the object of from the carotid stenosis patients with carotid artery intima stripped.Paraffin sections were made and were stained with HE routinely.Immunohistochemical method was used to examine the distribution of CD11b and CD83 positive reaction dendritic cells（DC）.ResultsCD83＋mDC and CD11b＋tolDC were mainly distributed in the carotid artery intimal plaque，foam cells and around the new blood vessels.The average number mature CD83＋mDC per high power field（HPF）was 8.34±1.20 and significant decrease was observed in the density of tolerogenic CD11b＋tolDC 5.31±1.24 cells／HPF，P＜0.05.Conclusions CD83＋mDC and CD11b＋tolDC were all both distributed in human carotid artery atherosclerotic arterial intima，and the increased in the number of mDC and the decreased in the number of tolDC may be associated with the development of carotid atherosclerosis.

Carotid stenosis；Dendritic Cells；Cell Count

R543.4

A

10.3969／J.issn.1672-6790.2014.01.015

2013-09-06）

安徽省自然科学基金项目（11040606M199）

邓琼，硕士在读，Email：18356039711＠163.com

胡何节，教授，硕士生导师，Email：huhejie＠hotmail.com

Corresponding auther：HU Hejie，Email：huhejie＠hotmail.com