CaO-SiO2／PAA复合膜的制备及其体外生物活性

项 兴，李晓宏，倪似愚

（东华大学 化学化工与生物工程学院，上海 201620）

CaO-SiO2／PAA复合膜的制备及其体外生物活性

项 兴，李晓宏，倪似愚

（东华大学 化学化工与生物工程学院，上海 201620）

以四水合硝酸钙为钙源、正硅酸乙酯为硅源（按CaO／SiO2摩尔比1∶1），采用溶胶-凝胶法制备出CaO-SiO2生物玻璃溶胶.采用压力诱导的方法将CaO-SiO2溶胶注入多孔阳极氧化铝（PAA）的纳米孔道中，经550℃热处理，得到CaO-SiO2／PAA复合膜.所得样品在模拟体液（SBF）中分别浸泡1和7 d，观察其表面诱导形成类骨磷灰石的能力.通过扫描电镜（SEM）、X射线能谱仪（EDS）、傅里叶变换红外衍射仪（FTIR）对浸泡前后样品的微观形貌和成分进行表征.试验结果表明：钙硅基生物活性材料能够装载在PAA的纳米孔道中，并且装载有钙硅基材料的PAA在SBF中浸泡后能诱导类骨磷灰石的生成.

CaO-SiO2；多孔阳极氧化铝（PAA）；模拟体液（SBF）；类骨磷灰石

多孔阳极氧化铝膜（porous anodic alumina，PAA）是通过电化学阳极氧化的方法在纯铝表面形成的具有纳米孔道结构的氧化铝薄膜.一般认为PAA是由六棱柱晶胞构成，相邻的晶胞以密堆积的方式排列，晶胞中心有纳米级孔道，这些孔道相互平行且与基体表面垂直，孔径从几纳米到几百纳米可调，是典型的自组织生长的纳米孔阵列材料［1-4］.近年来的研究表明，PAA具有良好的化学稳定性、生物相容性及仿生性能，其在医用金属表面的生物学和力学改性方面已显示出实际应用价值的潜力［5-7］.此外，PAA相互平行的大面积六角形排列的纳米孔道，也可作为生物活性物质的优良载体，从而赋予PAA纳米结构本身特殊的功能［8］.

过去的研究显示，钙硅基材料具有优良的生物活性和可降解性，能在体外和体内诱导类骨磷灰石快速沉积并促进骨细胞的增殖和分化［9-14］，这对于骨的迅速修复是非常重要的.近年来的研究结果进一步表明，钙硅基材料相比钙磷基材料具有更高的生物活性，并已作为填充和修复材料而广泛地应用于骨和关节上.鉴于钙硅基材料优良的生物活性和良好的可降解性，如果利用PAA纳米孔道的特殊性，向其孔道中装载适量的钙硅基生物活性材料，将有可能明显提高PAA的生物活性.因此，本文采用两步阳极氧化法制备大孔径的PAA，并采用压力诱导的方法将钙硅基生物活性材料装载入PAA纳米孔道中，考察所制备的样品在模拟体液（SBF）中诱导类骨磷灰石形成的能力，初步评价CaO-SiO2／PAA复合膜的体外生物活性.

1 试验部分

1.1 试剂

正硅酸乙酯（TEOS）、硝酸钙、硝酸、乙醇、磷酸、硫酸、草酸等，均为化学纯.

1.2 阳极氧化铝的制备及其表征

将厚度为0.3 mm的高纯铝片（99.999%）裁成80 mm×15 mm的长方形，400℃高温退火3 h后在乙醇、二氯甲烷和丙酮的混合液中（V（乙醇）∶V（二氯甲烷）∶V（丙酮）＝1∶2∶1）清洗2 min.随后以铝片为阳极，铅板为阴极，在磷酸和硫酸的混合液中进行电化学抛光，电流为4.8 A，温度为80℃，直到铝片变得如镜面般光亮.将抛光后的铝片放入盛有0.4 mol／L草酸溶液的低温电解槽中，铝片作为阳极，两块铅板作为对阴极平行放置于铝片两侧，接到恒压电源上，逐渐将电压升至40 V，进行第一次阳极氧化.3 h后，将铝片放在6%磷酸和1.8%铬酸的混合液中除去氧化层，再将其放入草酸电解液中进行第二次阳极氧化，温度和电压条件以及氧化时间与第一次阳极氧化过程相同.将经过上述处理的样品浸泡在5%磷酸溶液中，对氧化铝薄膜进行扩孔处理，去离子水洗涤，室温晾干即可进行检测.样品表面形貌分析在S-4800型（日本）场扫描电镜上进行，样品表面的化学组成分析在X-max型（英国）能谱仪上进行.

1.3 CaO-SiO2／PAA复合膜的制备及其表征

用硝酸做催化剂制备1 mol／L的TEOS水溶液，待TEOS水解完全后，将1 mol／L的硝酸钙水溶液缓慢地滴加在TEOS中，其中CaO／SiO2的摩尔比为1∶1.磁力搅拌器作用下充分反应1 h，静置待溶液形成透明的溶胶.将制得的PAA放入溶胶中浸泡，并将上述装有PAA的溶胶放在真空干燥箱中常温下抽真空3 h，然后取出溶胶中的PAA，置于马弗炉中，550℃热处理，升温速率为3℃／min，保温5 h后取出.其中，使用真空条件的目的在于抽出PAA孔道中的空气，在外界压强的作用下迫使溶胶进入PAA孔道中.样品用去离子水洗涤3遍，晾干待检.处理后的PAA材料分别用S-4800型（日本）场扫描电镜、X-max型（英国）能谱仪进行表征.

1.4 CaO-SiO2／PAA 复 合 膜 在 模 拟 体 液 中 浸 泡试验

通过体外浸泡SBF的方法来表征所制备复合材料的生物活性，以文献［15］的方法配制SBF，其离子浓度与人体体液相近，并用缓冲液调节其p H值为7.4.

表1 模拟体液和人体体液的离子浓度Table 1 Ion concentrations of SBF and human blood plasma mmol／L

将制备好的CaO-SiO2／PAA复合膜置于装有20 m L的SBF的塑料样品杯中，并将样品杯放在水浴振荡锅中，保持水温37℃，恒温振荡1和7 d，每天更换SBF溶液.浸泡结束后，用去离子水清洗两遍后，将样品置于75℃下干燥.通过S-4800型（日本）场扫描电镜观察样品的表面形貌，X-max型（英国）能谱仪检测样品元素组成，NEXUS670型（美国）傅里叶红外衍射仪检测样品的化学结构.

2 结果和讨论

2.1 PAA的表征

图1为两步阳极氧化法制备的PAA的表面和横截面SEM图.由图1（a）可知，制备的PAA呈蜂窝状结构，形貌较规整，孔径为150～200 nm，由图1（b）可以看出其厚度为20～30μm.PAA的X射线能谱（EDX）测试结果如图2所示.由图2可知，样品的表面化学组成为Al和O，并且Al／O的摩尔比为1∶2，而其他杂峰为观察样品时喷涂的Au.

图1 PAA的表面和横截面SEM图Fig.1 SEM images of surface and cross-section of PAA

图2 PAA的X射线能谱图Fig.2 EDS of PAA

2.2 CaO-SiO2／PAA复合膜的表征

CaO-SiO2／PAA复合膜的表面和横截面的SEM图如图3所示.由图3（a）可以看出，在PAA孔道中装载了很多细小的颗粒，这说明采用抽真空的方法可使溶胶进入PAA的孔道中，从而使CaOSiO2溶胶在PAA孔道中实现溶胶-凝胶的转化，经热处理后得到CaO-SiO2生物玻璃颗粒.图3（b）也显示细小的颗粒沉积在PAA的孔道中.

图3 CaO-SiO2／PAA复合膜表面和横截面的SEM图Fig.3 SEM images of surface and cross-section of CaO-SiO2／PAA composite film

对CaO-SiO2／PAA复合膜的表面和横截面的X射线能谱测试结果如图4所示.由图4可知，能谱上显示Ca、Si、Al和O的峰，其中，Al和O的峰是来自PAA，而Ca和Si的峰则是来自孔道中的颗粒，分析得出Ca／Si的摩尔比为3∶2.文献［16］报道的溶胶-凝胶生物玻璃的煅烧温度一般为500～800℃，而本研究中热处理温度为550℃，因此，认为装载在PAA孔道中的颗粒可能为CaO-SiO2生物玻璃.

图4 CaO-SiO2／PAA复合膜的X射线能谱图Fig.4 EDS of CaO-SiO2／PAA composite film

2.3 CaO-SiO2／PAA 复合膜在模拟体液中诱导类骨磷灰石形成的能力

在人体骨组织和生物活性材料界面之间形成的类骨磷灰石对两者的牢固键合起到至关重要的作用，材料表面诱导这种类骨磷灰石层沉积的能力可以通过体外浸泡SBF试验进行初步评价［17］，根据材料表面能否形成类骨磷灰石层及其形成速度来初步判断材料的生物活性.

CaO-SiO2／PAA复合膜在SBF中浸泡1和7 d后的表面SEM 照片如图5（a）和5（b）所示.由图5（a）可知，浸泡1 d后，在 CaO-SiO2／PAA 复合膜的表面形成了很多雪花状的颗粒，并且颗粒都分散在样品的表面.由图5（b）可知，浸泡7 d后，CaO-SiO2／PAA复合膜表面的颗粒增多，表面结构也更规整.与浸泡前（图3（a））相比，样品的表面形貌在浸泡后发生了明显的变化.

图5 CaO-SiO2／PAA复合膜在SBF中浸泡1和7 d后的表面SEM图Fig.5 SEM images of surface of CaO-SiO2／PAA composite film after soaking in SBF for 1 day and 7 days

为了分析样品表面形成物质的元素组成，对浸泡1和7 d后的CaO-SiO2／PAA复合膜进行了X射线能谱测试，其结果如图6所示.由图6（a）可知，图谱中出现了P的峰，说明在SBF中浸泡1 d后，CaO-SiO2／PAA复合膜表面有含P的物质生成.而由图6（b）可知，图谱中没有出现Si的峰.综合分析认为，CaO-SiO2／PAA复合膜在SBF中浸泡1 d后即能诱导Ca-P基物质形成，而浸泡7 d后，Ca-Si基物质基本上转化成Ca-P基物质.因为所采用的模拟体液中所含的Na和Cl量比较大，导致图6的谱图中出现Na和Cl的峰.

图6 CaO-SiO2／PAA复合膜在SBF中浸泡1和7 d后的X射线能谱图Fig.6 EDS of CaO-SiO2／PAA composite film after soaking in SBF for 1 day and 7 days

图7为CaO-SiO2／PAA复合膜在SBF中浸泡1和7 d后的傅里叶变换红外光谱图.由图7可知，样品在3 340 cm-1附近的吸收峰为OH-的伸缩振动吸收峰，620 cm-1附近的吸收峰为结合水的吸收峰，在1 150 cm-1附近的吸收峰是由于P的振动引起的，而1 410 cm-1附近的微弱吸收峰则是C引起的.因此，在CaO-SiO2／PAA复合膜表面形成的新物质层即为类骨磷灰石.文献［18］的研究表明，多孔阳极氧化铝为无定形Al2O3结构，由于在模拟体液环境中Al2O3表面所形成的Al-OH基团带正电，而不具有诱导磷灰石生成的能力，呈生物惰性.然而在本次试验中CaO-SiO2／PAA复合膜在SBF中浸泡之后却出现了类骨磷灰石层，表明所装载的CaOSiO2生物玻璃赋予了PAA良好的生物活性.

图7 CaO-SiO2／PAA复合膜在SBF中浸泡1和7 d后的傅里叶变换红外光谱图Fig.7 FTIR spectra of CaO-SiO2／PAA composite film after soaking in SBF for 1 day and 7 days

根据SBF中硅酸钙诱导类骨磷灰石沉积的机理［19］，在浸泡过程中，首先是钙硅基材料表面发生溶解，Ca2＋和Si4＋溶解释放到周围的溶液中，并与SBF中的 H＋交换导致溶液p H值上升.此外，CaSiO3溶出的Ca2＋和Si4＋，增加了周围SBF中的过饱和度.同时，Ca2＋的溶出速度高于Si4＋，从而很快在材料表面形成富硅层，富硅层的形成为类骨磷灰石提供了有利的成核质点，并进一步吸收周围环境中的Ca2＋、P和OH-形成类骨磷灰石层.本文的研究发现，CaO-SiO2／PAA复合膜在SBF中浸泡1 d后，EDX图谱中就能够观察到P的峰，说明装载了CaO-SiO2生物玻璃颗粒的PAA具有较强的诱导类骨磷灰石形成的能力.随着浸泡时间的延长（7 d），EDX图谱显示Si的峰消失，说明CaO-SiO2／PAA复合膜在SBF中浸泡7 d后，样品表面基本被类骨磷灰石层所覆盖.

3 结 语

本文采用溶胶-凝胶法制备CaO-SiO2溶胶，并将溶胶装载在PAA的孔道中，最终得到CaO-SiO2／PAA复合膜.体外SBF浸泡试验结果表明，装载有Ca-Si基生物活性材料的PAA在模拟体液中浸泡1和7 d后，均能在其表面诱导类骨磷灰石的形成.研究结果表明，CaO-SiO2／PAA复合膜具有良好的体外诱导类骨磷灰石形成的能力，初步显示出较好的生物活性，有望在生物医用金属材料表面改性方面获得应用.

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Synthesis andinvitroBioactivity of CaO-SiO2／PAA Composite Film

XIANGXing，LIXiao-hong，NISi-yu

（College of Chemistry，Chemical Engineering and Biotechnology，Donghua University，Shanghai 201620，China）

CaO-SiO2sols were prepared by a sol-gel technique using reagent-grade calcium nitrate tetrahydrate（Ca（NO3）2·4H2O）and tetraethoxysilane（TEOS，Si（OC2H5）4）as precursors with an initial CaO to SiO2molar ratio of 1∶1.The CaO-SiO2sols were then filled into the nano-pores of porous anodic alumina（PAA）by a pressure-induced technique under vacuum.After heat treatment at 550℃，the CaO-SiO2／PAA composite film was obtained.Theinvitroapatite formation ability of the samples was investigated by soaking them in simulated body fluid（SBF）for 1 day and 7 days respectively.The microstructure and chemical composition of the samples before and after soaking were analyzed by means of scanning electron microscope （SEM），X-ray energy dispersive spectroscopy （EDS）and Fourier transform infrared spectroscopy （FTIR）.The results indicated that the nano-porous structure of PAA could be loaded with CaO-SiO2bioactive materials and the Ca O-SiO2／PAA composite film could induce bone-like apatite formation on its surface.

CaO-SiO2；porous anodic alumina（PAA）；simulated body fluid（SBF）；bone-like apatite

TB 34；TQ 131.11

A

2012-11-14

国家自然科学基金资助项目（50902020）

项 兴（1986—），男，湖北黄冈人，硕士研究生，研究方向为纳米生物材料.E-mail：xiang1986xing＠163.com

倪似愚（联系人），女，副研究员，E-mail：synicn＠dhu.edu.cn

1671-0444（2014）01-0071-05